高效液相色谱法测定连钱草中齐墩果酸和熊果酸的含量.docx

高效液相色谱法测定连钱草中齐墩果酸和熊果酸的含量 连草是活血草科植物的一种昵称，头骨干燥，经络分散，皮肤香味，江苏金钱草；《中华人民共和国药典》2005年版收录了嘴唇科植物的活血丹龙目的（nakai）kubar干燥的土壤部分，具有润湿、祛瘀、杀瘀、祛斑的功能。对于连钱草药材的质量控制, 《中华人民共和国药典》 (2005年版一部) 主要通过性状、显微特征和熊果酸的薄层色谱来鉴别药材的真伪, 通过检查杂质、水分、总灰分和酸不溶性灰分以及测定醇溶性浸出物的含量来控制药材的质量。近年来, 有学者相继报道连钱草中三萜酸类成分 (主要为熊果酸和齐墩果酸) 和总黄酮的含量测定方法, 并以此来控制该药材的质量, 但主要限于江苏、安徽两地产的连钱草药材。湖北省连钱草资源非常丰富, 但其利用极为有限, 主要在民间用于治疗少儿腹泻, 笔者未见有关湖北产地连钱草药材质量控制方面的报道。笔者在本研究通过高效液相色谱 (HPLC) 法对5个湖北产地 (8个批次) 、3个其他省份连钱草中两种主要化学成分齐墩果酸和熊果酸的含量进行测定并比较评价, 同时对3种连钱草混淆品中的齐墩果酸和熊果酸进行考察, 为湖北省连钱草资源的开发利用提供科学依据, 也为连钱草药材质量控制标准的提升提供数据参考。 1 仪器和试剂盒 1.1 u3000试验设备 SUMMIT型高效液相色谱仪 (戴安, 美国) , 包括ASI-100TM自动进样器, TCC-100柱温箱, PDA-100二级管阵列检测器, P680泵。超声波清洗器 (JL.120, 上海杰理科技有限公司) 。旋转蒸发仪 (SHZ-3, 上海亚荣生化仪器厂) 。 1.2 实验试剂与材料 甲醇 (色谱纯, Fisher Scientific) , 甲醇 (分析纯, 天津市博迪化工有限公司) , 乙腈 (分析纯, 国药集团化学试剂有限公司) , 冰醋酸 (分析纯, 天津市博迪化工有限公司) , 实验用水均为双蒸水。 齐墩果酸对照品 (色谱级, 上海友思生物技术有限公司) , 熊果酸对照品 (色谱级) 。连钱草样品见表1。连钱草自行采集后, 除去杂质, 自然晾干, 粉碎, 过筛孔内径960 μm (20目) 筛, 使用前60 ℃干燥3 h。另取恩施3的连钱草样品, 将其茎和叶分开, 待用。 2 方法和结果 2.1 决策及色谱条件 色谱柱:大连依利特Hypersil ODS2 (4.6 mm×200 mm, 5 μm) ;流动相:甲醇-乙腈-1%冰醋酸溶液 (40:40:20) ;流速:1.0 mL·min-1;检测波长:210 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL, 所有待分析样品, 进样分析前均用0.22 μm有机系微孔滤膜过滤。理论板数按熊果酸色谱峰13 000, 分离度1.28;拖尾因子在 0.99～1.02之间。图1和图2分别是在此色谱条件下测得的齐墩果酸和熊果酸对照品溶液和连钱草甲醇提取物的色谱分离图。 2.2 对照溶液的制备 2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品0.011 2 g, 用甲醇溶解并定容至25 mL量瓶, 摇匀, 得齐墩果酸对照品储备液, 浓度为0.448 mg·mL-1。 2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取熊果酸对照品0.100 0 g, 用甲醇溶解并定容至50 mL量瓶, 摇匀, 得熊果酸对照品储备液, 浓度为2 mg·mL-1。 分别取适量体积的齐墩果酸和熊果酸对照品储备液, 用甲醇溶解并定容至10 mL量瓶, 摇匀, 配制成一系列浓度的对照品溶液。 2.3 供试品溶液的制备 分别称取各产地连钱草10 g, 加入50 mL甲醇, 超声提取30 min, 过滤, 重复3次, 合并滤液, 减压浓缩, 用甲醇溶解并定容至25 mL, 得供试品溶液。 2.4 齐墩乳酸和熊苹果的线性方程 按照“2.2”项下方法配制一系列浓度的对照品溶液, 以峰高 (H) 对浓度 (C) 进行线性回归, 得齐墩果酸的线性方程H=229.69C-4.755 8,r=0.999 7;熊果酸的线性方程H=265.46C-18.937,r=0.999 7。结果表明齐墩果酸在0.04 ～0.20 mg·mL-1, 熊果酸在0.40 ～0.75 mg·mL-1有良好的线性关系。 2.5 样品的加样回收 按照“2.2”项下配制对照品溶液3份, 每份对照品溶液连续进样分析3次, 测得齐墩果酸和熊果酸的峰高的RSD分别平均为0.80%和0.37%。 2.6 进样稳定性试验 称取同一批药材5份, 按照“2.3”制得供试品溶液, 按上述色谱条件进样分析, 测得齐墩果酸和熊果酸的峰高的RSD分别为1.95%和2.73%。结果表明, 该方法重复性较好。 2.7 溶液稳定性试验 称取咸宁产地连钱草10 g, 按照“2.3 ”