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印度梨形孢定殖对烟草生长发育的影响 土壤氮素的养分对叶片的产量和品质有显著影响。现在，中国的卷烟生产中存在施用氮肥的现象。随着氮素含量的增加，一些氮素以亚硝酸盐的形式被积累为纸张，导致纸张中的高剂量、化学成分不协调和叶片品质下降。印度梨形孢 (Piriformospora indica) 是一种类菌根真菌, 能够定殖于多种植物根部, 促进植物对土壤中营养元素的吸收, 具有显著的生物学促生效应, 同时能够提高植物对高盐、干旱、重金属等非生物逆境的抵抗能力, 有效增强植物对多种病害的抗性, 提高作物产量。有关印度梨形孢与植物互作的研究, 在拟南芥、大麦等模式植物上已有较多研究, 但在烟草生产上的研究却鲜见报道。因此, 实施了印度梨形孢定殖对不同氮素浓度下烟草生长发育和物质代谢影响的试验, 旨在了解印度梨形孢对烟草促生效应以及互作机理, 进而为在烟草生产上的应用提供依据。 1 材料和方法 1.1 德国法上的ralpoelmolus为赠与投育 印度梨形孢 (Piriformospora indica) 由德国耶拿大学Ralf Oelmuller教授惠赠;供试烟草品种为中烟100 (Nicotiana tabacum L.) , 由中国烟草总公司郑州烟草研究院提供。 1.2 样品准备 1.2.1 菌株设置及培养 使用KM培养基活化印度梨形孢, 于25℃黑暗条件下培养1周, 备用。使用打孔器在菌落边缘打孔取5 mm菌饼, 置于含有MS培养基、直径为9 cm的玻璃培养皿中, 处理为2片印度梨形孢菌饼, 对照为2片同样大小的KM空白培养基, 于25℃黑暗条件下培养1周。 1.2.2 烟苗定殖及氮素含量测定 选取外形饱满、大小一致的烟草种子, 无菌水浸泡过夜, 75%酒精表面消毒30 s, 无菌水冲洗1次;再用1%Na Cl O表面消毒10 min, 无菌水反复冲洗数次, 均匀点播于MS基本培养基上, 于25℃光照培养箱中萌发。两周后选取长势一致的烟苗分别移植到培养1周的印度梨形孢MS培养皿中 (1株/皿) , 对照培养皿置入同样大小的烟苗, 各培养皿均置于25℃/23℃ (白天/黑夜) 、16 h/8 h光暗周期、光强度为100μmol·m-2·s-1、相对湿度为60%的人工气候箱中培养。 平板共培养4周后, 台盼蓝染色观察印度梨形孢在烟草根部的定殖情况, 确保印度梨形孢成功定殖于烟草根部。挑选长势一致的烟苗移栽到基质 (蛭石∶珍珠岩=1∶2) 中, 随机排列, 采用上述相同条件在人工气候箱中培养, 每天定量浇灌含不同氮素浓度的霍格兰氏 (Hoagland) 营养液, 并略作调整 (使用氯化钙和氯化钾分别替代硝酸钙和硝酸钾) 。氮素营养设置为4, 8和12mmol/L硝酸铵使用量, 其中8 mmol/L硝酸铵相当于霍格兰氏营养液氮素的使用浓度, 为中氮素水平, 4和12mmol/L分别为低氮素和高氮素水平。 盆栽培养4周后, 于光照3.5~4.0 h后取样, 将烟草叶片去除主脉, 用锡箔纸迅速包裹后投于液氮中迅速冷冻, 真空冷冻机 (CHRIST ALPHA 1-4, 德国) 冷冻干燥至样品完全冻干, 使用多样品组织研磨仪 (Tissuelyser-48, 中国) 研成粉末, 保存于-80℃超低温冰箱中备用。 1.3 印度梨状唑酮对香烟草的刺激 1.3.1 固定的koh溶液 取少量印度梨形孢定殖的烟草根系, 用蒸馏水冲洗干净, 剪成1 cm长的片段, 置于10%KOH溶液中固定, 过夜。随后用蒸馏水冲洗数次, 再用1%HCl浸泡3~5min, 最后用0.05%的台盼蓝染色, 光学显微镜 (Olympus BX51, 日本) 40倍镜下观察印度梨形孢的定殖情况。 1.3.2 数据统计分析 取各处理和对照烟苗各5株, 测量株高、根长、叶片鲜质量以及根系鲜质量后, 将样品烘干至恒质量, 测定各部分干质量, 利用IBM SPSS 20.0软件进行数据的差异显著性分析。 选取烟株最上部功能叶 (距叶尖5 cm左右, 避开主脉) 采用LI-6400光合作用测定仪 (LI-COR, 美国) 测定其净光合速率, 每株测定3次, 各3次重复, 利用IBM SPSS 20.0软件进行差异显著性分析。 1.4 总氮、no3和no2的含量在看出 1.4.1 快速测定总氮含量 使用快速定氮仪 (ELEMENTAR, 德国) 采用杜马斯燃烧法测定烟叶中总氮含量。 1.4.2 no3和no2叶中的含量 采用Dionex ICS-2000离子色谱仪 (DIONEX, 美国) 检测烟叶中的NO3-和NO2-含量。 1.5 叶氏合金残留 1.5.1 gc/ms分析 根据参考文献, 采用Agilent 5890 GC-MS仪非靶向测定烟叶全组分, 并略作修改。具体方法:称取10