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大黄炮制减毒和化学成分改变的相关性研究 大黄历史悠久，疗效广泛。根据现代药理学的研究，含有的药物具有腹泻、止血、抗炎、抑制癌细胞克隆和诱导死亡等作用。大黄除应用于泻火通便外,近年来还常用于慢性肝炎、肾功能衰竭等疾病的长期治疗。然而,近年有报道大黄中成分对机体的肝肾功能有不良影响,长期应用可能引起肝肾损害。传统用药常根据辨证选择不同炮制品施治,以达到降低不良反应、减毒增效的目的。大黄经炮制降低致泻作用强度,从而减轻腹泻、腹痛等消化道不良反应已有深入研究。但炮制减毒理论对大黄肝肾毒性的影响尚未见系统研究。大黄主要含蒽醌及鞣质类活性物质,其中蒽醌衍生物是最主要的药效物质,鞣质也具有重要药理活性。这些不同类别和不同结构的成分与大黄肝肾毒性的相关性,以及炮制减毒的内在物质基础尚不明确。为此,本文以大黄不同炮制品为研究对象,平行比较其肝肾损伤差异,凸显炮制减毒作用,并通过典型相关分析方法,发掘化学成分与毒性效应两组变量间的相关性,从而找到大黄炮制减毒可能的物质基础。 仪器、检测和病理变化 材料与仪器掌叶大黄购于甘肃省礼县药材公司,经解放军第三〇二医院肖小河研究员鉴定为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.的干燥根及根茎。不同炮制品由上述同一批生大黄炮制而得,炮制方法参照《中国药典(2005年版)》及《北京市中药材炮制规范》,由北京冠城堂药材饮片有限公司协助完成。为了尽可能暴露大黄潜在的肝肾毒性,本文采用醇提与水提相结合的方式制备生大黄及其炮制品的总提物用于毒性比较研究。提取方法:将大黄粉碎得粗粉,加6倍量95%乙醇加热回流3次,每次1 h,合并滤液浓缩得醇提液,滤渣挥去乙醇,加10倍量水,加热提取1 h,滤液与醇提液合并,减压干燥得总提物。含量测定用芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚和没食子酸购自中国药品生物制品检定所,其他化学试剂均为分析纯。 昆明种小鼠,清洁级,体重18~22 g,雌雄各半,共230只,由中国药品生物制品检定所实验动物中心提供。动物饲养于屏障动物房,动物房合格证号SYXK(军)2002-005。室温(20±2)℃,相对湿度60%~70%,通风良好、环境安静,室内保持12 h照明,12 h黑暗,并定期消毒。 8450型紫外-可见分光光度仪(美国HP公司),2500型超声波清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司),旋转蒸发仪(德国Heidolph公司),全自动生化分析仪(OLYMPUS Au 800,日本),包埋机(AO,美国),切片机(AO,美国),光学显微镜(Galen TMⅢ,江南光学仪器厂)。 不同炮制品的亚急性毒性试验将动物随机分为7组,分别为正常对照组,生大黄(crude rhubarb,Crd-R)、酒大黄(alcohol-processed rhubarb,AR)、醋大黄(vinegar-processed rhubarb,VR)、熟大黄(steamed rhubarb,SR)、清宁片(qingning pian,QR)和大黄炭(carbonized rhubarb,Carb-R)组,每组10只,雌雄各半。各给药组剂量均为76 g·kg-1。按0.4 m L·10 g-1体重ig给药,对照组给相同量蒸馏水,连续给药14d。给药期间动物自由饮食。每日观察给药前后各剂量组每只动物的外观体征,行为活动,毛发变化、大小便形状、颜色,各天然孔有无异常分泌物等。分别在给药0、1、3、7、11、14 d称动物体重,计算体重增长率。连续给药14 d后,小鼠摘眼球取血,分离血清,检测谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌苷(CREA)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、A/G、总胆红素(TBIL)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(CHOL)指标。动物摘眼球取血后处死,进行全面系统尸检,对心、肝、脾、肺、肾、脑、性腺、甲状腺、胸腺、回肠等进行肉眼观察,记录有异常的脏器,称重并计算脏器系数。尸检后取肝、肾组织,用10%中性甲醛溶液固定,经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片(厚4~5μm)、HE染色。在光学显微镜下观察组织病理变化。 不同炮制品总蒽醌和鞣质含量测定参照文献采用乙酸镁-甲醇溶液显色,分光光度计测定大黄及其炮制品中总游离蒽醌(total anthraquinones,AQs)、总结合蒽醌(total anthraquinone glycosides,AQGs)含量。总鞣质(tannins,Tns)按2005年版《中国药典(一部)》附录X B“鞣质含量测定法”操作。 不同炮制品蒽醌单体含量测定按照2005年版《中国药典(一部)》大黄项下方法,采用高效液相色谱法测定大黄不同炮制品中5种蒽醌单体含量。盐酸水解后测得的为游离态和结合态蒽