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尼龙与鸡混合虫的分离与鉴定 通过对球虫的分离和提取，我们可以识别球虫的类型，建立球虫的简单序列系统，对进一步研究球虫的药物效应、抗性、寄生虫和球虫的适应性具有极其重要的意义。为给理论上和生产实践中球虫课题提供可靠的依据。国内学者对球虫单卵囊的分离技术进行过研究和报道,如田广孚、田增义曾用5厘米高的DEAE-52纤维素柱,以PH为8.0的甘氨酸缓冲液作为洗涤液对柔嫩艾美耳球虫进行了提纯。但因需特殊仪器,操作技术繁杂,且试剂价贵,一般设备条件根本无法办到。我们经过探索,得到设备要求不高,容易操作,一般实验室均能进行的鸡球虫卵囊的分离与纯化方法。用本方法进行堆型艾美耳球虫卵囊纯化孢子化后进行镜检,纯化率达90%以上。 1 材料表面 1.1 球虫囊的收集 从凤阳县农户散养鸡群中,选择具有球虫病典型症状的病鸡,收集新鲜粪便中的球虫卵囊,为混合球虫株。 * 安徽省科技厅重点项目 ** 本院2002届毕业生 顾有方:男,1964年出生,教授,博士,预防兽医学专业 1.2 试剂 2.5%重铬酸钾溶液,生理盐水,2%琼脂。 1.3 生物显微镜、分离针、受压缩机、水分散液、水改性变应变器的模拟 采集检查寄生虫虫卵常用的尼龙筛、平皿、双目生物显微镜、分离针、刀片、组织捣碎匀浆机、TDL-5离心机、WS2-134-75电热恒温培养箱、解剖器材、接种用注射器、橡胶管等。 1.4 试验动物 从本院附属畜牧场购进的一批健康的蛋公鸡。 2 鸡球囊肿的分离 2.1 沉淀物的提取 收集球虫病病鸡的新鲜粪便,倒入塑料桶或搪瓷盆中,加入水浸泡,并用260目的尼龙筛进行过滤,将得到的滤液静置沉淀24h左右,倒去上清液,如此反复进行几次,最后,收集沉淀物。 2.2 卵囊的芽孢化率测定 将上述沉淀物加入适量2.5%重铬酸钾溶液置于28℃恒温培养箱中培养,每天搅拌一次,并补加适量2.5%重铬酸钾溶液,同时进行镜检观察卵囊的孢子化率。 2.3 不同浓度沉渣的幼鸡感染 孢子化的卵囊培养液用TDL-5离心机离心(30×100rpm,10分钟)数次至上清液完全澄清,取沉渣饲喂雏鸡,对感染后的雏鸡采取严格隔离措施。注意观察鸡的精神状态、饮食、饮水等情况,至第7天扑杀,取病鸡小肠前段,用组织捣碎匀浆机磨碎,用2.5%重铬酸钾溶液置于28℃恒温培养箱中培养,镜检观察卵囊的孢子化率达70%~80%即可。 2.4 单囊球虫的分离 2.4.1 2%脂肪溶 将1g琼脂倒入100ml烧杯中,加水49ml,用水浴加热法加热至60~70℃,使琼脂完全溶解,即成2%的琼脂溶液。 2.4.2 球卵囊的观察 用滴管吸取2.5%重铬酸钾的球虫卵囊培养液,滴5滴于试管内,加生理盐水数毫升稀释,直至在显微镜低倍镜下观察到每个视野中有1~2个球虫卵囊为止。 2.4.3 球卵囊的分散 在干燥清洁的载玻片上先滴1滴2%的琼脂溶液,在液面上滴1滴稀释好的球虫卵囊液,再在上面滴1滴2%琼脂溶液,将球虫卵囊包埋,置载玻片于水平台处,待琼脂球虫卵囊液在载玻片上自然凝固后,用低倍镜检查,以有3个以内的球虫卵囊分散在琼脂内为止。 2.4.4 琼球卵囊分离 用双面刀片把载玻片上的球虫卵囊琼脂轻轻切割成小方块,用分离针和刀片把分割出来的一个琼脂球虫卵囊小块移至另一个载玻片上,在琼脂球虫卵囊小块面上滴1滴水,然后逐块从不同方位在低倍镜下观察,当确定每个琼脂球虫卵囊块内只有一个孢子化球虫卵囊时,鸡球虫单卵囊分离即达到目的。再用分离针和刀片把包埋有球虫单卵囊的琼脂块移至凹面玻片凹窝中,滴加适量生理盐水,放入平皿中备用。 3 球虫囊的纯度 3.1 球虫单卵囊的鸡体内脂的制备 将单卵囊分离好的小块琼脂饲喂15~20日龄的雏鸡,感染方法为一人左手拿刀片,右手拿分离针,把含有球虫单卵囊的琼脂从凹面玻璃片上挑起,另一人用拇指和食指将鸡嘴打开,把琼脂块小心拨到鸡的喉部,然后用干燥清洁滴管吸取生理盐水滴入鸡嘴中,让其咽下。 3.2 试验鸡的饲养 按雏鸡饲养标准配饲料,确保饲料中不含有球虫和抗球虫成分。饲养笼用福尔马林消毒暴晒后,感染试验的雏鸡单个饲养于笼中。试验期间饮水避免因外源性球虫感染而影响试验结果。在感染球虫单卵囊数小时前雏鸡只饮水,感染后才喂饲料。从感染后第四天开始,检查粪便,详细观察记录,球虫在雏鸡体内的潜伏期,临床症状以及球虫卵囊随粪便排出的情况。 3.3 磨碎机研磨化 取发病鸡小肠前段及其内容物,用组织捣碎机磨碎,用2.5%重铬酸钾溶液连同磨碎物于平皿内置28℃恒温培养箱孢子化,至完成孢子化后结合镜检判断。 4 剖检和饮水异常 经纯化后的孢子化的卵囊接种鸡,感染后经3天潜伏期,镜检粪便有少量卵囊,剖检尚无明显病理变化;第4天有水样粪便排出,同时混有未消化的饲料,剖检时,在十二指肠和小肠前段的粘膜上出现少量点线状的灰白色