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细胞自噬检测技术研究进展 自我反叛是指将细胞中的部分细胞器、杂质和溶酶体结合起来的过程。自噬包括三种类型:巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬, 其中研究最广泛的是巨自噬。近10年来, 自噬在哺乳动物机体发育及内环境平衡的研究领域取得了重大的进展。而关于自噬功能的下调与哺乳动物各种疾病之间密切相关性的研究, 使得自噬成为临床疾病治疗中的一个重要靶点。如何进一步准确地鉴别、观察、定量细胞自噬是哺乳动物自噬研究的基础。现就目前常见自噬检测技术的研究进展及优缺点予以综述。 一、 力学检测技术 1. 自噬体的识别 在超微结构水平上, 自噬体是一种双层膜结构, 包裹着尚未消化的胞内细胞器如线粒体或者高尔基体碎片。所以, 在电子显微镜下观察到双层膜自噬体结构是确认自噬体结构的金标准, 应用广泛。但是, 如何从电镜观察到的各种囊泡结构中准确地判断出真正的双层膜自噬体结构是电镜技术的核心所在。自噬早期, 双层膜包裹较完整细胞器底物的自噬体结构在电镜下比较容易识别, 但是在晚期形成的自噬溶酶体中, 膜性结构包裹着处于不同降解阶段的细胞器, 很难识别内容物来源, 与胞内其他膜性结构难以区分, 使得鉴别自噬体和其他内吞结构比较困难。一般认为, 不包裹或仅包裹少量内容物的囊泡结构不能被判定为自噬体。近年来有研究证实自噬对底物具有特异选择性, 所以电镜识别自噬应该考虑到双层膜内所包裹的不同细胞成分, 即需要鉴别过氧化物酶自噬、线粒体自噬、高尔基体自噬等。虽然电镜是一项非常有价值的自噬检测技术, 但尚有诸多缺陷, 而且在自噬的功能研究中应用十分有限。 2. dc和ao对酸性细胞器的标记 标记自噬溶酶体结构是以往应用较为广泛的检测技术, 譬如利用对pH敏感的AO染色标记酸性囊泡细胞器结构。AO是一种具有细胞渗透性的荧光染色方法, 可以染色DNA和胞质为亮绿色。AO也可以渗透进入酸性细胞器, 例如自噬溶酶体, 当pH值较低的时候, AO发出红色荧光, 且强度与酸性程度相关。所以在AO标记的细胞中, 酸性囊泡细胞器结构可以通过流式细胞仪或者在荧光显微镜下观察到。类似的MDC染色也是一种常用的酸性细胞器标记技术。 AO染色和MDC染色曾经一度被认为是标记自噬溶酶体的特异性方法, 但是后来发现AO及MDC与溶酶体也具有很高的亲和力, 难以与自噬溶酶体结构鉴别。而且有研究发现MDC荧光信号主要集中于核周, 而自噬体结构一般散在分布于细胞质。说明MDC并不是一种好的自噬体标记物。 二、 自噬检测技术 细胞自噬并非随机降解系统, 自噬系统对底物具有特异选择性, 所以通过检测特异性的自噬降解底物来标记自噬成为一项重要的自噬检测技术, 应用最为广泛的是对p62/sequestosome-1 (SQSTM1, 一种泛素样结合蛋白) 及长寿命蛋白的检测。 1. 细胞内p62/sqstm1的表达 p62/SQSTM1偶联于微管相关蛋白轻链3, 作为一种调节因子参与自噬体的构成, 在自噬的中、晚期被降解。所以细胞内整体p62水平的表达与自噬活性存在负相关。例如在饥饿诱导的自噬缺陷细胞中, 可以观察到p62/SQSTM1的蓄积。研究证实, 细胞内p62/SQSTM1的表达水平与多种自噬相关因子关系密切, 未来很有可能成为一个重要的自噬检测指标。但是, 细胞自噬是否为p62/SQSTM1惟一的降解途径尚不明确, p62/SQSTM1是否参与泛素介导的蛋白质降解途径还有待于进一步研究。而且, p62/SQSTM1在自噬机制中接受复杂的转录调控, 这进一步增大了通过检测p62/SQSTM1表达水平来标记自噬的难度。 2. 检测波长蛋白表达 细胞内物质主要有两条降解途径:即蛋白酶体系统降解及自噬系统降解, 蛋白酶体系统主要降解细胞内的短寿命蛋白, 而自噬则负责长寿命蛋白和部分细胞器的降解利用。在1970s自噬细胞试验研究中出现了一项重要的自噬定量检测技术, 即对长寿命蛋白大块降解产物的标记:将细胞与同位素标记的氨基酸共培养 (多为14C或3H标记的缬氨酸或亮氨酸) 数小时以标记长寿蛋白, 再经过一段潜伏期使蛋白酶体系统降解淘汰短寿命蛋白。随后经自噬刺激物诱导, 细胞内释放出的降解蛋白产物通过三氯乙酸-放射性同位素法定量测定, 从而获得一个精确的数值。此方法可以比较客观地反映细胞内长寿蛋白的命运, 而不是对自噬底物的简单标记。同时为确保检测结果反映的是自噬降解, 而不是其他可能存在的长寿蛋白降解通路, 需进一步对比观察添加或不添加自噬抑制剂时, 自噬降解率的变化。所以该方法的缺陷就在于对自噬抑制剂的特异性和效能性有高度的依赖, 其发展有待于更具特异性的自噬抑制剂或其他自噬拮抗手段的研究。 三、 tg蛋白在细胞内的分离和生成 自噬系统的启动需要保守的自噬相关基因产物 (Atg蛋白) 的参与, 包