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奶牛流产布氏杆菌的分离鉴定 布氏杆菌病是一种在世界上流行的人类疾病。世界动物卫生组织 (OIE) 将其列为B类动物疫病, 我国将其列为二类动物疫病。自1895年Marston等首次报道布氏杆菌病以来, 已经确定的布氏杆菌有6个种属20个生物型, 牛布氏菌病是引起牛流产的主要病因之一, 以流产布氏杆菌 (Brucella abortus) 感染最常见, 以母畜发生流产和不孕, 随子宫排泄物和乳汁排出病原菌, 公畜发生睾丸炎和不育为主要患病特征。 2005年1～5月, 黑龙江省大庆市2个牛场 (DC1和DC2) 、五常市1个牛场 (DC3) 和伊春市1个牛场的奶牛频繁发生流产。为弄清病因, 对4个牛场进行了流行病学调查, 同时采集病料, 通过病原分离鉴定、血清学诊断和PCR鉴定确定引起奶牛流产的主要病原菌, 为牛场布氏杆菌病的预防和控制提供依据。 1 材料和方法 1 材料表面 1.1 疾病宣言 1.2 培养基和试剂 2 方法 2.1 培养基细胞培养 将流产胎牛真胃内容物, 肝脏和脾脏等病料分别接种于10% 的新鲜绵羊血营养琼脂培养基, 分别做普通需氧、微需氧和厌氧 (烛缸法) 培养, 37 ℃培养 3～5 d后观察菌落形态和有无溶血情况, 并进行革兰染色、沙黄孔雀绿和改良Ziehl-Neelsen染色鉴定。 2.3 细菌的生化特性 2.4 菌株和引物 布氏杆菌IS711 (插入序列) 在数量和位置上都很保守, 所有的种在单染色体上都含有至少1个拷贝的IS711。根据布氏杆菌不同种IS711的不同设计4条引物, 分别用于鉴别流产布氏杆菌、猪布氏杆菌 (B.suis) 和羊布氏杆菌 (B.ovis)。引物由上海生物工程技术有限公司合成。 P1:5/- TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′; P2:5/- GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′; P3:5/- GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3′; P4:5/- CGGGTTCTGGCACCATCGTCG-3′。 P1和P2用于鉴定流产布氏杆菌, 扩增产物为498 bp;P1 和P3用于鉴定猪布氏杆菌, 扩增产物为285 bp;P1和P4用于鉴定羊布氏杆菌, 扩增产物为976 bp。 2.4.2 pcr和凝胶电泳 采用25 μl反应体系:引物浓度均为0.5 μmol/L, dNTP浓度200 μmol/L, LA Taq DNA聚合酶1.25 U, PCR 缓冲溶液 (100 mmol/L Tris-HCl, pH8.3, 50 mmol/L KCl, 0.1% BSA, 20 mmol/L MgCl2) , DNA模版1 μl, 补充去离子水至总体积为25 μl。反应参数:94 ℃预变性10 min;94 ℃变性50 s, 61.1 ℃退火1 min, 72 ℃延伸50 s, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。取8 μl PCR产物, 用1%的琼脂糖凝胶在0.15×TBE电泳液 (0.045 mol/L Tris-硼酸, 0.001 mol/L EDTA, pH8.0) 中电泳, EB 染色, 利用凝胶成像系统 (Gel Doc 2000) 观察扩增结果。 4个牛场送检75份流产奶牛血清。采用国标GB/T18646-2002动物布氏杆菌病诊断技术检测布氏杆菌抗体。同时采用衣原体间接血凝试验 (IHA) 检测上述血清, 按试剂盒使用说明操作。送检血清中DC110份, DC215份, DC320份, DC430份。 结果 1 年生反压h 4个牛场奶牛流产发生情况见表1。奶牛流产发生率为9.5% (102/1100) , 流产发生在妊娠期1～4周、5～7周和8周至产前者分别占9.8% (10/102) 、68.6% (70/102) 和21.6% (22/102) 。 2 病牛有莲子内皮炎 病牛流产前数天开始从阴门流出淡黄色恶臭液体;流产后多数病牛有子宫内膜炎, 人工授精比较困难;胎衣不下, 呈淡黄色胶冻样浸润, 可见纤维蛋白絮状物和脓性分泌物。 3 胎盘牛检查 流产胎牛多数皮下胶胨样水肿, 腹腔积液, 肝脏肿大, 脾脏稍肿大且质软, 肾脏胶胨样水肿。未发现畸胎。 4 细菌的分离和鉴定 4.1 培养基细菌生长和生物量 病料接种培养基, 需氧条件下培养3 d未见细菌生长, 培养1周观察仍未见细菌生长。厌氧培养和微需氧培养至第4 d, 接种真胃内容物的血液营养琼脂培养基均有细菌生长, 菌落中等大小, 圆形隆起, 表面光滑、湿润, 有光泽, 无色透明, 侧光观察呈轻微乳色和略带蓝灰色, 不溶血, 不易溶于生理盐水。2份流产胎牛的肝脏和脾脏材料经上述方法培养有相同细菌生长。 4.2 红色菌体的检测 取菌落涂片, 革兰染色和改良Ziehl-N