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定量十二指肠瘤胃微生物蛋白的定量 中国的牛奶蛋白质营养体系使用可消化的粗蛋白质素。进入肠道的蛋白质包括三个部分：肿瘤胃蛋白（rup）、肿瘤胃微生物蛋白（mcp）和内源性蛋白（ecp）。因此定量瘤胃微生物蛋白合成量至关重要。NRC (National research counsel) 1989采用以下公式来预测微生物蛋白的产量BCP, g/d=6.25× (-30.93+48.09×NEL) 。式中NEL为日泌乳净能摄入量 (兆焦, MJ) 。NRC2001用130 g微生物CP/kg总可消化养分 (TDN) 采食量计算。然而NEL和TDN这两个指标都是黑箱指标, 着眼点在日粮和排泄物上而不在瘤胃, 有很大的局限性。当含有相同泌乳净能的大麦和玉米分别饲喂给奶牛时, 由于它们的淀粉在瘤胃中的发酵程度并不相同, 微生物蛋白的产量也不相同。新的NRC蛋白质与氨基酸营养体系中需要定量饲料原料的过瘤胃蛋白 (rumen undegradable protein, RUP) 引起了对用体内方法定量真胃微生物蛋白 (MCP) 流量的关注。尽管几种体外发估测过瘤胃蛋白的方法如模拟实验动物法、移动尼龙袋法、溶解度法已经建立, 但需要用体内的方法 (In vivo) 进行校正。体内方法确定瘤胃非降解蛋白需要确定非氨氮 (NAN, non-ammonia nitrogen) , 微生物蛋白的流量和内源氮 (endogenous crude protein) 。NRC2001假定内源氮为1.9 gN/kg干物质采食量, 其中每一步测定都有误差会对最终的计算结果产生较大影响。 1 酶活过程模拟 在NRC标准中将来源于瘤胃降解蛋白 (rumen degradable protein, RDP) 的氨态氮 (ammonia nitro-gen, AN) 和来自于氨基酸、肽的a-氨基氮看成是等效的。Maeng报道体外法用氨基酸的混合物25%替代培养液中的氨态氮显著的提高了微生物蛋白的产量。Argyle和Baldwin体外研究发现, 向只含有氨态氮的培养液中加入1、10、100mg N/L的肽和氨基酸的混合物可以显著提高菌体蛋白产量。在不添加碳水化合物的培养液中只有100mg N/L的肽和氨基酸的混合物提高了微生物蛋白的产量, 而在1、10mg N/L没有提高, 说明肽和氨基酸在高浓度时作为了微生物生长的能量来源。体内方法研究表明, 含有58%苜蓿青贮和42%精料日粮条件下奶牛瘤胃氨基酸和肽的浓度分别为72和43mg N/L。他们同时发现只有添加氨基酸和肽的混合物才能提高菌体蛋白的产量, 而单独添加氨基酸或者肽对混合微生物几乎没有影响。Stokes发现在连续培养系统中, 当瘤胃降解蛋白供给充足的情况下, 菌体蛋白的产量随着非结构性碳水化合物浓度的提高而呈现线性提高的趋势。 另外一些因素如瘤胃pH值、瘤胃稀释率和高精料日粮的饲喂频率都会影响到菌体蛋白的产量。日粮的瘤胃可利用非结构性碳水化合物 (rumen available non-structural carbohydrate, RANSC) 和瘤胃可利用蛋白质 (rumen available protein, RAP) 的同步化会阻止瘤胃微生物的发酵与生长的解偶联 (uncouple)。需要用简单、灵敏、可靠的定量微生物蛋白的技术来验证微生物蛋白是日粮泌乳净能NEL的函数理论的可靠性。 2 标记的类型出现在饲料中 微生物标记分为内标 (internal marker) 和外标 (external marker) 两类, 理想的标记包括以下特征: ①易于定量; ②在饲料中并不存在; ③在特定的试验条件下比例恒定; ④具有生物学稳定性。 3 内部锚点的类型和特点 3.1 日粮饲料中dap和蛋白质比例的变化 DAP是在瘤胃微生物细胞壁寡肽中发现的一种特殊氨基酸。混合瘤胃细菌DAP和微生物蛋白质的比例恒定。因此, DAP被很多人用作内标来估测瘤胃细菌蛋白质合成。DAP只在瘤胃细菌细胞壁中存在意味着它在总瘤胃细菌蛋白质中的浓度会随着改变大细胞平均大小的条件而发生变化。有利于大细胞生长的条件将会降低细胞壁和原生质的比例, 降低DAP和蛋白质的比例。增加或者减少DAP或没有DAP含量细菌的瘤胃条件明显会改变总体DAP和蛋白质的比例。研究表明在同种日粮条件下DAP和蛋白质的比例随着饲喂后时间、固相菌和液相菌之间没有显著变化。 使用DAP作为标记物的另一个问题是在饲料原料中发现了DAP的存在。Rahnema和Theurer报道在常用饲料原料中DAP和蛋白质的比例占到分离细菌的18%~40%。他们建议进入到真胃的DAP的流量应该用日粮DAP进食量进行校正。然而饲料中的DAP很难在试验室条件下进行分离测定。 在分离瘤胃原虫时