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化学发光免疫分析技术研究进展 化学发光免疫分析（clia）是结合高灵敏度化学发光检测和高特异性免疫反应的综合分析技术而进行的。它用于检测各种抗、半抗、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物。是继放射免疫分析、酶联免疫分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。自从1977 年Tsuji 等提出了化学发光免疫分析技术以来,经过三十多年的发展,目前已成为融合众多学科知识的一种检测技术,在临床检验、药物分析、环境监测等领域得到广泛的应用。特别是在近几年得到了快速发展。本文作者已于2007年在《分析试验室》针对“化学发光免疫分析技术新进展”发表了综述文章[A1],本文就近三年来(2007年至今)国内外对化学发光免疫分析从理论研究到应用研究的最新研究动态做一简要评述。 1 化还原反应 化学发光反应(Chemiluminescence, CL)是一种物质在催化剂的作用下,经过氧化还原反应,由基态跃迁到激发态,而激发态不稳定再回到基态时释放出能量所表现出的光发射。常见的发光体系有鲁米诺、吖啶酯、过氧草酸酯以及二氧杂环丁烷类等化学发光体系。在这些反应体系中,研究较多的是基于鲁米诺的发光反应体系,特别是在氧化剂、增敏剂以及催化剂等方面做了大量深入的研究工作。 1.1 [aghoo6]结构 鲁米诺(Luminol)在碱性条件下鲁米诺能被氧化剂氧化,生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸根离子(3-APA*),而产生化学发光。在鲁米诺的发光体系中,通常所用的氧化剂均为强氧化剂如H2O2、K3Fe(CN)6、HIO4、KMnO4、BrO-等。目前Shi等[B1]提出了用[Ag(HIO6)2]5-作为氧化剂的鲁米诺发光反应体系(luminol-Ag(Ⅲ)体系),Ag(Ⅲ)复合物的结构是以Ag3+为中心与2个HIO64-离子共价结合的平面结构,其在碱性溶液中相当稳定。因此,在0.04 mol/L KOH碱性溶液中,当[Ag(HIO6)2]5-浓度为2.5 ×10-5mol/L,luminol浓度为2.0×10-7mol/L时, luminol-Ag(Ⅲ)体系的发光强度达到最大。同样,二羟基二过碘酸合镍(Ⅳ)(Diperiodatonickelate,DPN)也可以作为鲁米诺发光反应的氧化剂,使luminol在浓度极低的条件下产生发光反应,建立了luminol-DPN发光反应体系。文献报道该体系中luminol浓度低于10-8mol/L时也能检测到明显的光强度,而一般的luminol-H2O2体系则不能[B2]。 1.2 luminol-h2-hrp-bpb发光体系 研究表明,一些物质对鲁米诺的化学发光反应具有增强作用。作为经典的发光增强剂,苯酚衍生物的作用机理是苯氧基自由基作为辣根过氧化物酶(HRP)与鲁米诺电子传递的介质而增强其电子迁移速率以及增加HRP的转化率,从而起到增强发光的作用。Dotsikas等[B3]比较了5种不同对位取代基的苯酚衍生物4-甲氧苯酚(4-MEP)、4-羟基苯(4-BIP)、4-(1H-吡咯-1-基)苯酚(4-PYP)、4-咪唑苯酚(4-IMP)、4-碘苯酚(4-IOP) 对鲁米诺发光反应体系的影响。结果表明在luminol-HRP-H2O2反应体系中,该5种苯酚衍生物均能够增强发光强度,其中4-IMP增强幅度最大,4-PYP、4-BIP、4-IOP、4-MEP依顺序递减。这是由于取代基的电子特性(如共振效应)影响了自由基的稳定性,从而影响其相应的发光强度。当取代基为芳香环或者含杂原子(如氮原子)时,所对应的苯氧基自由基由于π-离域效应而更加稳定。若取代基为给电子基团时,由于能降低O-H键的离解能而使得苯氧基自由基更稳定,从而更能增强其发光强度。2009年,Bi等[B4]建立了溴酚蓝(Bromophenol blue, BPB)作为发光增强剂的luminol-H2O2-HRP-BPB发光体系,结果显示加入溴酚蓝后大大提高了发光强度。与常用的发光增强剂对碘酚 (p-Iodophenol, PIP) 相比,该体系发光强度高出近七倍。报道同时指出该反应的发光体仍然是3-氨基邻苯二甲酸根离子,溴酚蓝没有导致新的发光体出现。BPB的增强作用机理与其他酚类化合物如PIP类似,但增强程度与其结构有关,由于在BPB分子中引入了芳香环,形成了共轭的离域π键,提高了体系的共轭程度,增加了反应过程中苯氧自由基的稳定性,从而显示相对较强的增强效果。luminol-H2O2-HRP-BPB增强化学发光体系的最佳反应条件为:luminol溶液的pH为11.0,H2O2-HRP-BPB混合溶液的pH为5.2,luminol溶液的浓度为5.0×10-4mol/L,H2O2溶液的浓度为3.0×10-4mol/L,BPB溶液的浓度为8.0