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大肠杆菌表达系统研究进展 到目前为止，已经研究了多个原始核和真实核的生产系统。与其它系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、可以大规模发酵培养的优点，是现阶段最常用的表达系统。但在外源基因表达过程中，还可能存在着表达效率不高、活性不够等问题。笔者从表达量、表达活性、实验步骤的简化和成本控制4个方面综述大肠杆菌表达系统及其最新的研究进展,为人们了解大肠杆菌系统的表达机理，更好的选择适合目的蛋白表达的大肠杆菌系统提供参考。 1 表达变量 1.1 对稀土元素的监督 在蛋白质翻译过程中，t RNA携带相应的氨基酸与核糖体上的A位作用，如果上到A位的t RNA与该密码子相对应，就可进行肽链的合成与延伸。原核生物中，由于不同t RNA含量上的差异产生了对密码子偏爱性。t RNA丰富的密码子，正确的氨基酸会很快连接上。而t RNA稀少的密码子，要经过多次相互辨认才能找到正确的t RNA，外源蛋白的合成将因此停顿，如果相同的稀有密码子连续出现，会抑制蛋白质合成，发生密码子错配。统计E.coli中密码子使用情况发现：AGA、AGC、AUA、CCG、CCT、CTC、CGA、GTC8种密码子是大肠杆菌的稀有密码子。含有较高比例的稀有密码子的外源基因，表达效率往往不高，应针对密码子的偏爱性采取措施，如采用非连续多核苷酸定点突变方法对cDNA中稀有密码子进行同义突变,或提高某种氨基酸的t RNA浓度。Novagen公司的Roset t aTM大肠杆菌菌株就可以提高多种稀有密码子的t RNA量。 同时，Sr i ni vasan G等报道Methanosarcina barkeri甲胺转甲基酶基因中UAG密码子编码了一个赖氨酸衍生物。因此，在重组蛋白表达中应避免使用UAG作终止密码子，防止转录过程的通读。 1.2 蛋白表达系统 增强子是基因表达的重要调节元件，目前在病毒、植物、动物和人类正常细胞里都发现有增强子存在。在原核细胞中也发现类增强子序列。增强子在一定程度上可以提高大肠杆菌表达系统的表达效率。Ω序列是烟草花叶病毒(TMV)的5′端非翻译区的一段68 bp序列。Ω序列已广泛应用于构建植物表达载体，增强外源基因在植物中的表达。罗文新等用Ω序列对p ET24(+)载体的转录调控区进行改造，以T7启动子和Ω序列为调控元件构建了两种E.coli融合蛋白表达载体，并通过增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达检测其表达效率，与同时构建的不含Ω序列的p ET24(+)载体的表达产量进行比较研究。结果表明Ω序列能显著提高p ET24(+)载体的表达效率。 1.3 提升外源基因表达 外源基因转录出的m RNA一级与二级结构与外源蛋白的合成有很大关系，也是影响表达效率的重要因素之一。 m RNA一级结构对翻译效率的影响已有较多研究。转录出的m RNA 5′上游的SD序列与ATG之间的碱基数目和碱基组成对目的基因的翻译效率也很重要。一般认为，间距以6～11个碱基为最好，而碱基组成以C+G比例不超过50%为好。 影响外源基因在大肠杆菌中表达的另一个因素是翻译起始区(TI R)的二级结构,TI R指一切与翻译起始有关的顺式序列，包括RBS及其它参与二级结构形成并影响翻译的序列。降低TI R二级结构稳定性可以提高翻译起始效率，提高m RNA稳定性，有利于外源基因表达。沈芸等报道通过改变原有载体的TI R区域的序列，成功开发出一个高效表达载体。 1.4 蛋白酶缺陷型 大肠杆菌表达的重组蛋白可能会被大肠杆菌中的蛋白酶降解，I nvi t r ogen等公司都已开发出蛋白酶缺陷型菌株，使用蛋白酶缺陷型菌株可以减少外源蛋白被降解的可能，从而提高一些重组蛋白的表达水平。 2 对蛋白的作用 对于蛋白质工程来说，不仅要获得高产量重组蛋白，更重要的是保证蛋白的生物学活性，即可溶性和功能性———带有必需的磷酸基团、正确的二硫键与四级结构的完整蛋白。 2.1 复性再折合技术 在E.coli中表达的异源蛋白往往以不溶的包涵体形式存在，需经一系列的变性复性过程才能得到可溶的活性蛋白。由于复性再折叠方法复杂，成本较高，近年来在E.coli中直接表达正确折叠的异源蛋白技术已成为一个研究热点。为得到有活性的蛋白分子，可采用如下方法。 2.1.1 分子学习中的dna也具有未编码肽 分子伴侣是一类分布很广泛的蛋白质，其功能是介导其他蛋白质的折叠装配。分子伴侣能阻止多肽链之间因正电疏水区短暂暴露而发生的不正确作用，防止错误的装配。 在E.coli细胞中，存在三种具有广泛特异性的伴侣复合物：一是由60 kD的Gr o EL与10 kD的Gr o ES两种热休克蛋白(Hsp)组成的Gr o ES/EL；二是由Dna K(Hsp70)与Dna J、Gr p E组成的伴侣复合物，新生肽链通过与Dna J作