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工业微生物菌种选育技术 微生物是发酵行业的重要因素。决定发酵过程的成功，以及特定发酵产品是否具有工业化价值。自然界中的原始菌株大多不具有很高的工业化价值,因此需要对菌株进行选育和改良,以提高产品的质量,降低成本。原生质体融合技术是起源于20世纪60年代的一项重要的菌种改良技术,是将亲株细胞分别去除细胞壁后进行融合,经基因组间的交换重组,获得融合子的过程。与其他育种技术相比,原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整且不需要完全了解作用机制等优点,因而被国内外微生物育种学者广泛应用。 1974年,匈牙利的Ferenczy成功将白地霉(Geotrichum candidum) 营养缺陷型突变株的原生质体进行融合,使原生质体融合技术首次应用于微生物中。接下来的几十年,该技术的基本实验方法逐步完善,现已作为一项十分有用的技术广泛应用于工业微生物菌种选育中。本文就原生质体融合技术的过程及其应用于微生物育种方面的最新进展做了简要综述,并分析了目前存在的问题及未来的发展方向。 1 原生质体诱导融合,遗传稳定性分析 原生质体融合技术一般分成五大步骤:直接亲本及其遗传标记选择,双亲本原生质体制备和再生,亲本原生质体诱导融合,融合重组体筛选,遗传特性分析和测定。 1.1 最佳酶浓度和作用时间的确定 原生质体的制备首先要去除细胞壁,当前去壁的方法主要有机械法、非酶法和酶法,现在使用较多的为酶法。在放线菌和细菌中,主要采用溶菌酶,酵母菌和霉菌一般用蜗牛酶、消解酶或纤维素酶等。影响原生质体制备和再生的因素很多:在菌龄上,为了使细胞易于原生质体化,一般选择对数生长期或生长中期的菌体,也有的采用生长后期的菌。酶浓度以及作用时间也会影响原生质体的制备和再生率,一般来说酶浓度越高,作用时间越长,原生质体制备率就越高,但酶解时间过长又会影响再生率。对于不同的菌体,优化其最适酶浓度和作用时间非常必要。本实验室在琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)的原生质体制备和再生实验中发现采用对数生长中期的菌更易于原生质体化,在酶解琥珀酸放线杆菌(A.succinogenes)过程中,最适的酶浓度大大低于其他革兰氏阴性菌,且最佳酶解时间较短,原生质体的再生率高。另外,菌体的预处理,酶的处理温度,渗透压稳定剂等都会影响微生物原生质体的制备和再生。 1.2 peg的选择 由于在自然条件下,原生质体发生融合的频率非常低,因此在实际育种过程中要采用一定方法进行人为诱导融合。在微生物原生质体融合中,诱导融合方法主要有化学法(一般采用PEG结合高Ca2+、pH诱导法)、物理法(包括电融合和激光诱导融合法等)。 当用PEG法诱导原生质体融合时,很多因素影响融合频率。如PEG聚合度、PEG浓度和作用时间、离子种类和浓度、融合剂pH、温度等。一般来说相对分子质量为1 000-6 000的PEG都是有效的,PEG的浓度为30%~50%,不同相对分子质量的PEG溶液在相同质量分数时是同效的。在融合过程中,适量的Ca2+、Mg2+有助于融合,而K+、Na+则会降低融合率。PEG溶液一加入,融合就能较长时间地有效进行,但由于PEG有一定的毒性,因而大部分学者认为PEG处理时间一般控制在1~10min即可。 1.3 组合子的筛选 1.3.1 基因信息融合子检测 融合双亲为不同的营养缺陷型,原生质体融合后于基本培养基进行培养。由于双亲都丧失了合成某种物质的能力,在基本培养基上不能生长,而在融合子中,缺陷的遗传物质得到互补,所以可在基本培养基上长出菌落,利用这种方法即可检出融合子。Dai等以大肠杆菌(Escherichia coli)W4183(Arg-)及Fu20-1(Leu-)为亲本进行融合,在不加Arg、Leu的培养基上筛选出融合子。 1.3.2 基于融合子的筛选 微生物的抗药性是由遗传物质决定的,不同种微生物对同种药物的抗性存在差异,利用这种差异即可对融合子进行筛选。杨合同等将带有抗苯菌灵标记的哈茨木霉菌株(Trichoderma harzianum)T9和带有潮霉素B标记的康宁木霉菌株(T.koningii)Tk7a进行原生质体融合,用含有苯菌灵和潮霉素B的平板筛选,得到带有两亲本共同抗性的融合子。 1.3.3 再生后的融合子 通过灭活标记筛选融合子是指将单亲或双亲的原生质体经紫外线照射、加热或经过某些化学药剂处理,使其丧失在再生培养基上再生的能力,两亲株融合后,融合子损伤互补,因而可在再生培养基上存活。骆健美等将两株高产褐黄孢链霉菌(Streptomyces Gilvosporeus) SG-2002-1和SG-2002-2的原生质体分别经过紫外灭活和热灭活后融合,形成能够生长繁殖的融合子。这种方法省略了对双亲株的遗传标记, 使