基因表达与功能基因学.docxVIP

基因表达与功能基因学 自1995年出版以来，已经完成了42种微生物遗传因素的筛选，包括杆菌和肠球菌。这些全基因组序列的测定为进一步研究各种微生物的基因功能奠定了基础。研究基因功能的重要方法之一是构建基因的突变体来检测其表型的变化,以推测某个基因在生长过程中起到怎样的作用。最直接的方法是将目的基因敲除,这样可以保证被研究的基因完全失活。微生物基因敲除的传统方法是利用微生物本身的RecA重组系统。RecA重组系统是大肠杆菌内源性的同源重组机构,它由RecA和RecBCD组成。RecA蛋白促进各类DNA分子间的同源联会、配对以及链交换和分支迁移。RecBCD分子量较大、是一个由RecB,RecC和RecD组成的复合体,功能多样,是ATP依赖的外切酶V和解旋酶,它与双链切口结合,解开DNA并在Chi位点产生单链DNA,继而由RecA蛋白促进同源重组。 由于RecBCD具有核酸外切酶V的活性,所以线性DNA分子在细菌体内会被降解,必须要以环形的质粒状态存在才能不被分解。而且必须将靶基因两侧至少200 bp的DNA序列克隆至自杀质粒上,并在其中间插入抗药性基因。通过结合转移,依靠RecA同源重组系统将自杀质粒整合于细菌的染色体上。整合于染色体上的自杀质粒又可以发生第二次同源重组,重组的结果会有两种可能:一是把目的基因敲除,通过抗药性基因的筛选,就可以筛选到二次重组子(即基因敲除的缺失突变体);另一种情况是回复为原始的分子状态。利用RecA重组进行的基因敲除为研究微生物基因的功能奠定了重要的技术基础。应用较广的主要有定点突变、变性双链法实现基因敲除等技术。但是以RecA重组为基础的基因敲除具有较大的不足之处。首先是需要较长的靶基因同源臂,且必须构建具有靶位点的打靶质粒。另外是RecA重组发生几率很低,很难获得所需要的重组子。近来由Murphy和Stewart等人用噬菌体λ的Red重组系统在大肠杆菌中建立的快速敲除原核基因的方法简化了实验操作,使实验周期大大缩短。下面对Red重组系统的组成、重组机理及在微生物基因敲除中的应用做一综述。 1 蛋白及gam基因的结构特点 Red重组系统属于λ噬菌体的重组系统,其编码基因exo、bet和gam置于PL操纵子的控制之下。exo基因的产物是λ核酸外切酶,它可将dsDNA 5′端切开,产生3′端突出。由结晶学研究发现,该核酸外切酶在溶液中是环形三聚体,具有一个到达中心的通道,一端可以调节dsDNA,另一端调节ssDNA。bet基因编码的β蛋白,可与ssDNA结合促进互补链的复性,并可以介导DNA链退火和交换反应。它在溶液中的游离状态为环状物,当结合到ssDNA时形成大的环状物,当结合到dsDNA时形成螺旋状纤维。这些结构特点揭示了β蛋白属于重组蛋白家族中的一员,该家族包括Salmonella噬菌体P22的Erf蛋白,E.coli隐蔽型原噬菌体Rac的RecT蛋白,真核生物的Rad52蛋白。β蛋白与λ核酸外切酶形成复合物,调节核酸溶解(nucleolytic)和重组启动。gam基因的产物是一个分子量为16000Da的多肽,结合到宿主的RecBCD蛋白,形成二聚体,抑制RecBCD的外切酶活性。另外E.coli隐蔽型原嗜菌体Rac的重组系统与Red重组系统相似。前者的recE与exo相似,编码一种核酸外切酶;recT与bet相似,编码一种结合于ssDNA促使链交换的蛋白。二者的重组机理相同,可以说是同一类重组系统。 2 同源重组ssd-pcr检测 有关λ噬菌体重组系统方面的研究已有数十年的历史,自上世纪60年代始,就有人报导λ编码的产物可以促进细菌发生重组,Clark和他的同事发现具有λRed系统的菌株在同源重组时不依赖细菌本身的重组系统。因而认为Red重组是一个独立的重组系统。其重组的分子机制如下: 同源重组涉及到参与重组的两条dsDNA的断裂和复合。在Red重组系统中,该系统表达的Gam蛋白抑制了宿主RecBCD的所有外切酶活性。然后通过自身表达的λ核酸外切酶和β蛋白完成两条发生同源重组的dsDNA的断裂和复合,剩余重组步骤在宿主蛋白的作用下完成。 当发生重组的两条dsDNA都有断裂切口,且不在同一位点时,Red重组系统将以退火的形式促进两条dsDNA的断裂和复合(图1右):λ核酸外切酶结合到两条dsDNA的切口末端,自5′末端向内切割DNA,留下游离的3′末端,在β蛋白的介导下两条双链DNA的单链区发生退火,缺口在连接酶作用下重新连接,形成新的DNA分子。 当发生重组的两条dsDNA中只有一条断裂,另一保持完整时,重组将以侵入的形式进行(图1左):λ核酸外切酶结合到断裂的dsDNA的切口处,酶切形成游离3′单链DNA区段。在RecA、β蛋白和一些其他因子的共同作用下,3′单链DNA区段侵入到另一dsD