钛表面改性钛对骨髓基质干细胞生物学行为的影响.docxVIP

钛表面改性钛对骨髓基质干细胞生物学行为的影响 0 基质表面改性的研究 根据kasemo和其他描述材料的界面反应方法，钛表面的重建是解决这些问题的有效方法。目前，钛表面的生物特性已成为这一领域的热点和难点。对此国内外进行了大量研究, 采用基质中的各种活性成分如胶原、生长因子等进行改性, 并已取得较为肯定的效果, 但任何单一的某种活性成分都无法完全模拟天然基质的组成和功能。对于是否可以用胞外基质整体作为一种生物材料进行表面改性研究仍有待探索, 目前国内尚未见类似报道。实验将细胞自分泌的胞外全基质也作为钛表面生物化改性的一个方向, 以成骨细胞自行分泌的胞外全基质修饰钛表面, 初步探讨骨髓基质细胞在该材料表面黏附和铺展的生物学行为。 1 细胞培养和基质化钛片的制备 设计:细胞-材料学体外对照观察。 时间及地点:于2008-12/2009-02在安徽医科大学医学生物工程实验室完成。 材料:SPF级新生1~3 d龄SD乳鼠2只, SD大鼠2只, 由安徽省实验动物中心提供, 动物质量合格证号:SCXK (皖) 2005-001, 实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。 实验方法: 钛片的制作和处理:取直径12 mm的钛棒, 加工成厚1 mm纯钛片, 用金相砂纸打磨至镜面效果后研磨加工, 依次经丙酮、乙醇、蒸馏水各超声清洗30 min, 去除材料表面因机械加工而残留的油污, 高温高压消毒备用。 成骨细胞的培养:采用改良组织块法培养成骨细胞。SD乳鼠断颈处死, 放入体积分数为75%的乙醇中浸泡消毒5 min, 无菌操作取下颅盖骨组织, 除去附着的血管及结缔组织, 用Hank液清洗3次, 剪成1 mm3大小的碎块, 用2.5 g/L胰蛋白酶在37℃消化20 min;中止消化后, 用弯吸管吸取碎骨片, 均匀接种于25 m L的培养瓶中, 翻转培养瓶, 置37℃孵箱中2.0~3.0 h, 转正培养瓶并加入含体积分数为20%小牛血清的高糖DMEM培养液, 继续培养3 d后换液, 7~10 d后待细胞融合成单层再传代培养。 骨髓基质干细胞的培养:采用全血贴壁法培养骨髓基质干细胞。SD大鼠脱颈处死, 用体积分数为75%的乙醇浸泡20 min, 取股骨和胫骨, 剔去附着软组织, 以PBS冲洗2遍后剪开骨头中端, 露出骨髓腔。用含体积分数为15%新生小牛血清的DMEM培养液冲洗骨髓腔, 反复3次。收集所得细胞悬浊液, 接种于50 m L塑料培养瓶, 置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养。接种24 h后细胞贴壁, 第1次换液, 此后每三四天换液1次。待细胞长满培养瓶底形成单层后, 用2.5 g/L胰蛋白酶消化, 按1∶2传代培养。 基质化钛片的构建:将消毒后的钛片放入24孔培养板中, 用DMEM培养液将成骨细胞浓度调整为3×108L-1, 取1 m L/孔接种于24孔板中的钛片上, 培养三四天直至细胞长满钛片表面, 反复冻融3次, 0.01 mol/L PBS漂洗3次除去细胞碎片。 骨髓基质干细胞的接种:取生长良好的第3代骨髓基质干细胞, 分为基质化钛片组、纯钛片组, 用DMEM培养液将其浓度调整为1×108L-1, 分别接种于24孔板中的基质化钛片和纯钛片上, 1 m L/孔, 两组试样各6片。 细胞黏附率MTT法检测:接种4 h后, 从两组各取3片试样, PBS漂洗10 min去除未黏附细胞, 置入另一块24孔板中, 按试剂盒说明操作, 每孔加入500μL培养液和50μL MTT, 37℃继续培养4 h, 吸除培养液, 每孔加入500μL溶解液, 37℃继续培养20 min, 振荡3 min, 570 nm波长测吸光度值。 荧光免疫组化观察:接种后4, 24, 72 h两组各取2片试样, 2.5%戊二醛固定, PBS漂洗3次, 3 min/次, 孵育beta-actin一抗, 4℃过夜。荧光二抗在室温下孵育1 h, 荧光显微观察。 基质化钛片表面细胞黏附扫描电镜观察:接种后4, 24, 72 h两组各取1片试样, PBS漂洗15 min, 2.5%戊二醛固定, 乙醇系列脱水, 冷冻干燥, 喷金, 扫描电镜观察。 主要观察指标: (1) 钛片表面形貌扫描电镜观察。 (2) MTT检测分析细胞的早期黏附情况。 (3) 细胞铺展情况形态学观察。 设计、实施、评估者:实验设计、结果评估为第一作者, 干预实施为全部作者, 均受过专业培训, 未使用盲法评估。 统计学分析:由第一作者使用EXCEL工作表中的两样本t检验进行统计处理。 2 结果 2.1 用钛片表面电泳仪观察，纯钛片表面呈不规则凹凸，如图1所示 成骨细胞生长过的基质化钛片表面凹凸纹路明显减少, 看似有一层胶质掩盖住原有形貌, 见图2。 2.2 基质化钛片对