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h036和p311的免疫共沉淀技术验证 p311基因是研究团队根据早期生殖器细胞的早期发现而选择的一种高度发现的差异基因。同时，根据p311基因的异质基因在p311基因转化为纤维细胞后，可以促进纤维细胞转化为肌肉细胞。p311在伤口纤维修复和增生性疤痕的发展过程中发挥着重要作用。因此，它被用作与增生性疤痕相关的新药物方案。然而P311促成纤维细胞-肌成纤维细胞转分化的分子机制尚不清楚, 因此我们又利用酵母双杂交技术对P311的相互作用蛋白进行了初步筛选, 获得了一个能与P311发生相互作用的新蛋白——未知蛋白HT036。在此基础上, 为了在活体细胞内进一步证实HT036与P311间的相互作用, 我们分别构建了P311的融合蛋白Myc-P311和HT036 的融合蛋白HA-HT036的表达载体pCMV-Myc-p311和pCMV-HA-HT036, 共转染HEK293细胞后, 利用免疫共沉淀验证P311与HT036间是否存在着相互作用。 1 材料和方法 1.1 试剂和试剂器 大肠杆菌DH5α、含P311基因序列的重组载体pCMV-Myc-p311和含HT036编码序列的重组载体pACT2-HT036均为本研究小组保存试剂。pCMV-HA载体、Myc单抗和HA多抗均购自Clontech公司, HRP标记的羊抗兔IgG及化学发光液购自博士德公司, 细胞裂解液RIPA购自Santa Cruz公司, PVDF膜购自Millipore公司, 蛋白标准品 (Biotinylated Protein Ladder) 及其检测抗体 (Anti-biotin HRP-linked antibody) 购自康成公司, 分子生物学操作所用工具酶购自TaKaRa公司, 质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Omega公司, 胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxford公司, 琼脂粉、琼脂糖等购自上海生工, DMEM购自Gibco公司, 转染剂Lipofetamine 2000购自Invitrogen公司。 1.2 方法 1.2.1 凝胶的切割和回收 分别根据pACT2-HT036和空载体pCMV-HA的特点, 进行SfiⅠ和XhoⅠ双酶切;0.6%琼脂糖凝胶电泳酶切产物后, 紫外灯下分别切割含目的片段和载体的凝胶, 用胶回收试剂盒进行回收;T4DNA连接酶分别连接胶回收产物 (16 ℃, 1 h) 并转化连接产物至DH5α, 挑取单菌落进行质粒扩增, 用SfiⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定连接产物, 并用0.8%琼脂糖凝胶电泳酶切产物。 1.2.2 t065的分别转染 按2×105/孔接种HEK293细胞至六孔板中, 待细胞长至90%融合时共转染pCMV-Myc-p311和pCMV-HA-HT036, 以pCMV-Myc-p311和pCMV-HA-HT036的分别转染为对照组。具体方法:①将10 μg DNA用250 μl不含抗生素的无菌无血清DMEM稀释并混匀后, 室温孵育5 min。②用240 μl不含抗生素的无菌无血清DMEM稀释10 μl Lipofectamine 2000并混匀后, 室温孵育5 min。③将①和②中混合液进行混和即成转染混合液, 室温孵育15 min。④将六孔板中培养基换用1 ml不含抗生素的无菌无血清DMEM, 加入转染混合液, 并轻柔混匀, 置于CO2培养箱中 (37 ℃, 5%CO2) 孵育。⑤4 h后, 弃去培养基, 换用含10%小牛血清之DMEM继续培养。 1.2.3 小鼠抗同克隆抗体电泳 转染48 h后, 弃去培养基, 在冰上进行后续操作。刮下细胞, 用冷PBS液冲洗2遍, 离心, 弃上清, 加入100 μl RIPA, 冰浴30 min, 加入1 μg小鼠抗Myc单克隆抗体, 4 ℃旋转混合2 h, 加入20 μl 蛋白A, 继续混合12 h, 离心, 去上清后, 用RIPA洗沉淀3遍, 加入20 μl 2×Tricine SDS上样缓冲液, 煮沸5 min, 稍离心后, 立即进行电泳。 1.2.4 半干电转的兔抗ha多克隆抗体的分离和鉴定 用10%Tricine SDS胶对样品进行电泳, 每孔上样量为20 μl, 蛋白标准品上样量为10 μl, 用半干电转仪转膜后, 5%脱脂奶粉封闭1 h, 然后加入1∶2 000稀释的兔抗HA多克隆抗体, 4 ℃过夜孵育后, 0.1%TBST洗膜, 3次, 5 min/次, 加入1∶10 000稀释的羊抗兔IgG和1∶10 000稀释的蛋白标准品检测抗体, 室温孵育30 min, 洗膜, 方法同前, 根据操作说明, 加入化学发光液, 于Bio-Rad凝胶成像仪中进行显影。 2 结果 2.1 pcvm-table11酶切后ht06 经酶切、电泳后获得的图谱显示 (图1) , 近250 bp处的条