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elisa技术在食品安全检测与分析中的应用 食品是人类生存和发展的物质基础，而食品安全问题是人类健康和经济生活的一个重要问题。作为W T O的新成员,我国与世界各国间的贸易往来日益增加,食品安全已经成为影响农业和食品工业竞争力的关键因素,并在某种程度上制约了我国农业产业结构和食品工业的战略性调整。 目前,全球食品安全形势不容乐观,主要表现为食源性疾病、恶性食品污染不断上升和部分食品生产加工新技术与新工艺带来新的危害。其中有的病例不多,但病死率高、社会影响大,如猪肉中的瘦肉精(盐酸克伦特罗)残留;有的引起众多消费者急性发病乃至死亡,如肠出血性大肠杆菌O157:H7食物中毒;也有化学污染物造成广泛的食品污染,对人体健康具有长期和严重的潜在健康危害,如二噁英、农药和兽药残留的污染等。对于目前一些公认的重要食源性危害(如:农药残留、兽药残留、抗生素残留、重要有机物污染、生物毒素、食品添加剂和人兽共患疾病病原体等),在检测技术方面,不少尚属空白或不能够完善,不能满足食品安全控制的需要。因此,随着经济的发展,大多数国家开始对食品的安全性问题提出更高的要求,检测技术日益趋向于高技术化、系列化、速测化、便携化和易商品化发展。即便是在各种新型检测技术不断涌现的今天,运用免疫学和生物工程技术所建立的酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)技术,即ELISA,因其操作程序的规范化、简单化和检测的高灵敏性,仍然表现出其独特的优势并在农药残留、兽药残留、重要有机物污染、生物毒素、食品添加剂和人兽共患疾病病原体的快速检测和分析等食品安全性检测领域中有着广泛的发展前景。 1 elisa的生物检测技术 ELISA技术自本世纪70年代出现开始,就因其高度的准确性、特异性、适用范围宽、检测速度快以及费用低等优点,而在临床和生物疾病诊断与控制等领域中倍受重视,成为检验中最为广泛应用的方法之一。特别是随着蛋白质分离纯化技术和基因工程技术的不断发展,各种高纯度抗体、抗原和抗体复合物得以制备,单克隆抗体技术的应用,使得该诊断检测技术在特异性、灵敏度和客观性方面都有了大幅度的提高,并且在自动化免疫技术的推进之下进一步具有了精确的定量分析能力。由于ELISA的技术条件要求低、携带方便、常以试剂盒的形式出现且易商品化、操作简便和经济实惠,它已成为一种应用最为广泛和发展最为成熟的生物检测与分析技术。 ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。根据酶反应底物显色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定具有极高的灵敏度[1~4]。在应用中一般采用商品化的试剂盒进行测定,其特点是将抗原或抗体制成固相制剂,在与标本中抗体或抗原反应后,只需经过固相的洗涤,就可以达到抗原抗体复合物与其他物质的分离,简化了操作步骤。完整的ELISA试剂盒包含以下各组分:(1)包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);(2)酶标记的抗原或抗体;(3)酶的底物;(4)阴性和阳性对照品(定性测定),参考标准品和控制血清(定量测定);(5)结合物及标本的稀释液;(6)洗涤液;(7)酶反应终止液。结合物为酶标记的抗体(或抗原),是ELISA中最关键的试剂。良好的结合物既保持了酶的催化活性,也保持了抗体(或抗原)的免疫活性。在ELISA中,常用的酶为辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)。在少数商品ELISA试剂中,应用的酶有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物。国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶(AP)作为标记酶。酶标记抗体的制备主要有戊二醛交联法和过碘酸盐氧化两种方法。酶结合物一般需经离子交换层析或分子筛分离纯化。 随着ELISA在生物检测分析领域的广泛应用,根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,逐渐演变出了几种不同类型的检测方法:(1)双抗体夹心法测抗原或抗体;(2)间接法测抗体;(3)双位点一步法;(4)竞争法;(5)捕获法测Ig M抗体;(6)ABS(avidin biotin system)-ELISA法;(7)PCR-ELISA法;(8)斑点免疫酶结合试验(DIA)等。 2 定量分析复杂过程 抗体抗原反应所特有的专一性和敏感性,使得食品在未经分离提取的情况下,即可进行定量定性分析,而一般的化学分析都必须经过分离提取等复杂过程。近年来,该项技术在食品安全性检测中正逐步得以推广应用,如天然毒性物、农药残留、微生物污染、食品成分和伪劣食品等方面的检测分析。 2.1 黄曲霉素aat 真菌毒素(mycotoxin)是真菌产生的次级代谢产物,其中的十几种对人类危害