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新疆花蚕豆根腐病菌的分离、培养和致病性研究 甘薯是一种广泛分布于世界各地的蔬菜和豆类。它主要分布在黄淮地区和黑龙江恢复区。随着人民生活水平的提高,对包括花芸豆在内的豆类食品种类和数量的需求越来越多。然而,多种病害时常危害花芸豆的种植,其中根腐病是花芸豆的重要病害之一,一般可减产10%~20%,重病地可减产40%,甚至绝收。因此,查明花芸豆根腐病病原,掌握其发病规律并制定相应的防治措施,对于花芸豆种植业健康发展无疑具有重要意义。 近年来,花芸豆在新疆的种植面积不断扩大,同时根腐病的发病率也不断上升。虽然,已经从病原、病原的生物学特性及药剂处理多角度尝试进行了花芸豆根腐病的初步研究,但新疆相关花芸豆根腐病的研究还极少。因此,本研究旨在探索不同条件下花芸豆根腐病的发病规律,为花芸豆根腐病的防治提供科学依据。 1 材料和方法 1.1 材料表面 供试品种为黑河2号,由阿勒泰地区布尔津县布尔津乡种子公司提供。病土、病株采集于布尔津花芸豆连作5年以上的发病田。 1.2 样品的制备 1.2.1 培养基pda 将采集回来的病株、病土和带菌种子分别接入普通培养基[马铃薯葡萄糖(PDA)]和专选择性培养基(察氏、胡萝卜、没食子、燕麦琼脂培养基)上。在25~27 ℃下培养,待长出孢子后进行单孢分离、纯化培养,将长满菌丝的培养基风干后粉碎、封装;同时制备空白培养基一份。 1.2.2 细菌滤液的制备 取病原菌-培养基及空白-培养基各20 g,加入1 000 mL无菌水,在恒温条件下浸提42 h,过滤后得到病原原液和空白培养基原液。 1.3 花制定苗的培养方法 土壤进行高温灭菌,种子、花盆严格消毒,花盆直径150 mm,每盆播种10粒,置于25~27 ℃下恒温培育幼苗,2 d浇1次蒸馏水。病原滤液浓度在10×10倍显微镜下,每视野8~10个孢子,于花芸豆播种的当天、第6 d和第10 d各接1次,每盆20 mL,重复3次,以空白培养基为对照。第20 d用水将盆土充分浸泡,将土坨轻轻倒出,用流水慢慢冲洗附泥,检测根部发病情况。 1.4 室内生物学特性试验 1.4.1 预处理4.5 温度试验:温度梯度为5 ℃,10 ℃,15 ℃,20 ℃,25 ℃,光照时间0 h,通气条件为棉塞封口; pH值为7。 光长试验:光照时间为8 h,12 h,16 h,温度为20 ℃,通气条件为棉塞封口,pH 7。 通气条件试验:通气条件为胶塞封口、棉塞封口、纱布封口, 光照时间0 h,pH 7。 酸碱度试验:pH值梯度为3,4,5,6,7,8,光照时间0 h,温度为20 ℃,通气条件为棉塞封口。将浸有病原滤液的滤纸圆饼(直径6 mm)接入PDA培养基上,蒸馏水为对照,重复3次。分别于48 h,72 h,96 h测量菌落生长半径。 1.4.2 试验条件及试验结果 温度梯度为 10 ℃,15 ℃,20 ℃,25 ℃;土壤含水量梯度为4%,8%,12%,16%,20%; pH梯度为4.0,5.0,6.0, 7.0,8.0;容重梯度为1.0,1.1,1.2,1.3,1.5。试验除温度试验外均在15 ℃恒温下进行,光照条件均为12 h,花盆为150 mm,每盆病土重500 g,播种10粒,3次重复。2 d补蒸馏水1次,第20 d洗根,检测发病情况。 1.5 内部防御试验 1.5.1 d/l模型材料的制备 选取7种杀菌剂:50%多菌灵、70%甲基托布津、50%福美双、70%甲霜灵锰锌、50%拌种双、50%五氯硝基苯、50%甲基立枯灵的可湿性粉剂,加入蒸馏水配制成1 000,2 000,4 000 mg/kg溶液。每一溶液吸10 mL药液均匀平铺于75 mm PDA培养基上,无菌水为对照。将制备好的4种病原滤液按1∶1的比例混合,把沾有病原滤液混合液的滤纸圆饼(直径6 mm)接入铺有药液的培养基上,每皿3个,重复3次,空白滤液为对照。于24~26 ℃恒温培养,14 d测量病原的生长直径。 1.5.2 不同温度对盆菌土壤温度的影响见表1 7种杀菌剂(同上)分别处理种子,药剂量为种子重量的0.2%。每盆菌土 500 g,播种10粒,清水处理为对照,重复3次。分别置于15 ℃下恒温培养,2 d补灭菌水1次。第 18 d洗根调查发病情况。 1.5.3 播深410的强制播 种子处理同上,小区面积 9 m×9 m。于4月10日,4月20日2次播种,播深 5 cm,播量140 g/m2,3行为一个处理,各处理随机排列,重复3次。待花芸豆幼苗出土后,调查出苗数,以后结合间、定苗,每10 d抽取20株苗调查病情指数。 2 结果与分析 2.1 室内病原体的生物学特性测试 2.1.1 芽孢杆菌属heterwelling、立枯丝核菌f.oxsporum、木刑法 经不同培养基分离纯化,共获得4个真菌分离株,根据病原形态