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穗花杉随机扩增多态性dna条件优化 穗花杉是红杉科的一种植物。这是中国特有的国家保护植物和第三个世纪的遗迹。它对研究中国南方植物区系的产生和发展具有重要的价值。由于穗花杉形状独特，生长优美，种子成熟，有鲜红色的假种皮，材料优良，因此可以作为优良的园林观赏树种和材料树种。 随机扩增多态DNA(Random amplified polymirphism DNA, RAPD)分析是建立在PCR反应基础上的一种的分子生物学技术,它具有引物可以随机设计、所需DNA量少、操作技术简单、快速等优点,近年来已被广泛应用于分析物种的遗传多样性.但由于其重复性、稳定性较差,因此必须对其扩增反应条件进行优化.本实验对穗花杉RAPD反应条件进行了优化,旨在为后续遗传多样性的分析建立一个最优的RAPD扩增体系. 1 材料和方法 1.1 试验材料 实验用穗花杉叶片采自江西宜丰官山.采后立即冰冻,带回实验室洗净、晾干后置于-70 ℃超低温冰箱中保存备用. 1.2 pcr和upv-80凝胶成像系统 TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司,Mg2+、dNTPs、随机引物、λDNA/Hind III+EcorRI Marker和GeneRuler/100bp DNA Ladder Plus Marker均购自上海生工公司;PCR仪为PTC-200型(美国MJ Research 公司);电泳仪及电泳槽均由北京六一厂生产;UPV-8000凝胶成像系统为Ultra-Violet Products Ltd生产;2000型UV-型分光光度计为尤尼柯(上海)仪器有限公司生产. 1.3 dna纯度和含量的测定 DNA的制备与定量参照CTAB改良法,称0.125 g新鲜叶片,用液氮研磨成粉状,转入1.5 mL离心管中.加入1 mL、-20 ℃的丙酮,轻轻震荡1 min后于5 000 rpm离心10 min,去上清后再重复上述丙酮处理一次.向管中加入预热60 ℃的 CTAB 1 mL,60℃温育4 h,后加入500 μL氯仿∶异戊醇(24∶1),抽提10 min后以13 000 rpm离心10 min,取上清重复上述抽提直至不见蛋白沉淀.取上清加入2/3体积的冷异丙醇,轻轻混匀后,于2 000～3 000 rpm离心3 min.沉淀用70%的乙醇在室温洗涤20 min后,1 000 rpm离心10 min.沉淀于室温干燥后用50 μL TE缓冲液溶解.采用紫外可见分光光度计测定DNA纯度和含量. 1.4 rapd反应条件设置 本实验选用引物S41(ACCGCGAAGG)对各反应因素进行优化. (1)模板DNA含量对RAPD扩增反应的影响:实验中设置模板含量梯度分别为15,25,35,50,70,100,130 ng.(2)TaqDNA聚合酶含量对RAPD扩增反应的影响:实验中设置酶含量梯度分别为0.5,0.8,1.0,1.5,2.0,2.5 U.(3)Mg2+浓度对RAPD扩增反应的影响:实验中设置Mg2+浓度梯度分别为1.0,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0 mmol/L.(4)dNTP浓度对RAPD扩增反应的影响:实验中设置dNTP的浓度梯度分别为0.15,0.20,0.25,0.30,0.35 mmol/L.(5)引物浓度对RAPD扩增反应的影响:实验中设置引物浓度梯度分别为0.15,0.30,0.45,0.60,0.75,0.90 μmol/L. 以上除扩增反应变量外,其余试剂的用量及反应条件为:模板量70 ng、2×Taq酶buffer 2 μL,0.2 mmol/LdNTP、2.5 mmol/L Mg2+浓度、1.5 UTaq酶、0.45 μmol/L引物.扩增反应完成后,取10 μL的产物在1.4%的琼脂糖凝胶上,1×TBE缓冲液中电泳,稳压电泳2 h左右,Marker作分子量标准,用凝胶成相仪拍照检测. 2 结果与分析 2.1 种方法所提基因组dna含量和纯度 DNA的检测用改良CTAB对穗花杉基因组进行提取,经电泳分析显示其大小为23 kb左右(图1,M为标准分子量参照物,以下同).通过紫外分光光度计测定基因组DNA含量和纯度.本实验对比了几种处理方法对基因组DNA提取的影响,结果表明:与未用丙酮进行前处理相比,提取穗花杉基因组DNA采用丙酮前处理去除色素,所得提取产物基因组DNA物纯度较高,故在提取基因组DNA前用丙酮进行处理.同时研究表明,在2～4 h范围内,CTAB抽提时间的长短对提取的基因组DNA产量和纯度影响不大. 2.2 pcr扩增结果 RAPD扩增反应的影响据文献报道,在RAPD分析时,不同植物所需的模板DNA量各不相同.为确定穗花杉RAPD扩增反应所需最适模板DNA量,本实验共设置了7个模板DNA含量梯度进行优化.由PCR扩增结果可知(图