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竹柏叶hplc特征指纹图谱研究 竹柏树又称红松、罗汉柴、椰子、山脚下、铁甲树等。这是罗汉松科的一种常见树种，分布在广东省南部，生长于广东省大部分地区。近年来, 竹柏的抗肿瘤作用日渐引起人们的注意, 在竹柏的分类学和叶的挥发油方面也进行了一些研究, 竹柏种子中所含竹柏内酯A、1-去氧-2β∶3β-环氧竹柏内酯A、1-去氧-2α-羟基竹柏内酯A有较强的细胞毒性作用, 此外, 笔者参与了竹柏类植物的生药学相关研究。竹柏除了含挥发油外, 其黄酮类成分也是最主要的有效成分。黄酮类成分包括穗花杉双黄酮、金松双黄酮等, 其中穗花杉双黄酮的含量在竹柏叶化学成分中含量较高。本研究以穗花杉双黄酮作为对照品, 采用超声醇溶液提取, 对采集到的8批竹柏叶中的醇提物进行特征图谱研究, 并应用国家药典委员会推荐的分析软件, 对8个样品中的醇溶成分进行中药指纹图谱鉴别分析。初步得到不同批次竹柏叶中醇溶部分各成分的相对含量状况, 现报道如下。 1 材料表面 1.1 仪器和试剂盒 2 方法和结果 2.1 仪器、试药和仪器 BS124S电子分析天平和BS211p电子分析天平 (德国Sartorius公司) ;HWS-28电动恒温水浴锅 (上海一恒电子仪器厂) ;Agilent 1100高效液相色谱仪 (美国安捷伦科技有限公司) ;TCQ-250型超声清洗器 (北京医疗设备二厂) 。穗花杉双黄酮对照品由广东省中医研究所提供, 纯度为99.8%;乙腈为色谱纯, 磷酸、甲醇等均为分析纯, 水为三蒸水。 1.2 检测部位和温度 竹柏采集于广东省广州市, 原植物经蔡岳文主任中药师鉴定分别为罗汉松科竹柏Podocarpus nagi (Thun.) Zoll et Mor和长叶竹柏。采集部位为叶, 采集时间为2007年10月30日。 Agilent Hypersil ODS C18柱 (4.6mm×150 mm, 5μm) ;以乙腈-0.05%磷酸水溶液为流动相, 梯度洗脱, 乙腈由15%~100%;洗脱时间30 min, 检测波长为310 nm。流速1.0 mL/min, 柱温20℃。理论塔板数按穗花杉双黄酮计应不低于5 000。 2.2 供试品溶液的制备 取药材样品, 剪碎, 取约0.5 g, 精密称定, 置50 mL具塞锥形瓶中, 加体积分数50%乙醇10 mL, 称质量, 超声提取30min, 取出, 置冷, 称质量, 补足损失的质量, 摇匀, 用0.22μm微孔滤膜滤过, 滤液做为供试品溶液。 2.3 对照溶液的制备 精密称取穗花杉双黄酮对照品适量, 加甲醇溶解, 配制成浓度为0.013mg/mL的对照品溶液。 2.4 方法研究 2.4.1 精密度实验结果 取同一供试品溶液, 连续进样6次, 其相对保留时间稳定, 主要共有峰相对保留时间和相对峰面积的相对标准偏差 (sR) 均小于2.9%, 结果表明精密度较好。 2.4.2 供试品溶液稳定性 取同一供试品溶液, 分别于0、1、2、3、4、24 h检测, 其相对保留时间稳定, 主要共有峰相对保留时间sR和相对峰面积sR均小于3.2%, 结果表明供试品溶液24 h内稳定性好。 2.4.3 重现性测定 取同一样品号的供试品6份, 分别处理测定, 其相对保留时间稳定, 主要共有峰相对保留时间sR和相对峰面积sR均小于3.6%, 结果表明重现性良好。 2.5 结果 2.5.1 指纹图谱的建立 指纹图谱建立的原则应从色谱的整体性出发, 确定能构成指纹图谱的色谱峰的峰号、峰位、峰数。经比较所有测定和记录的色谱图, 确定竹柏叶样品的共有峰组成其指纹图谱, 同时找出主要特征指纹峰。对照品、供试品HPLC图谱见图1。 2.5.2 指纹色谱检测 按供试品制备方法分别对竹柏叶 (8个样品) 进行处理测定, 以穗花杉双黄酮对照品峰 (S) 为参照峰 (见图1) , 分别进行指纹色谱峰标号, 标示出8个竹柏药材有21个共有峰, 见图2。 2.5.3 指纹图谱的特征 以穗花杉双黄酮色谱峰 (保留时间RT为12.01 min) 为标准峰, 对各个样品指纹色谱进行分析。在竹柏叶方面, 从保留时间上看, 8个竹柏叶样品指纹图谱相似程度很高, 共有峰有21个;从整个图谱看, 各个色谱峰分离度高, 基线平, 色谱峰特征性强, 8个竹柏叶样品指纹图谱图貌比较相似, 特别是在第二区间 (RT=10.00~25.00 min) 。但不同样品之间也存在差异, 主要表现在第一区间 (RT=1.00~10.00 min) 。 2.5.4. 1.竹白叶8个样品的指纹相似性分析 图3 (见彩图页第497页) 结果显示:指纹图谱相似程度很高, 特别是在第二区间 (RT=10.00~25.00min) 。 2.5.4. 2.竹白叶8个样品的指纹相似度分析 以13号峰 (穗