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-谷甾醇对胃癌sgc-7501细胞杀伤作用机制的研究 近年来，消化系肿瘤的发病率逐渐增加，治疗主要以手术和放疗为主。然而，晚期肿瘤患者失去了手术的机会，无法承受放疗和放疗的强烈毒副作用。因此，提高患者的生存率和生活质量已成为治疗的重点。随着肿瘤免疫学的发展, 肿瘤过继免疫治疗成为目前肿瘤治疗的热点。应用多种细胞因子和刺激分子联合诱导培养的人PBMC (共刺激细胞) 是具有高度杀伤活性的免疫效应细胞, 刘军权等报告, 共刺激细胞对胃癌细胞SGC-7901、胰腺癌细胞SW-1990、结肠癌细胞SW-1116、人肺癌细胞株A549、乳腺癌细胞株MFC-7和人黑素瘤细胞株HME1杀伤活性明显高于CIK细胞。β-谷甾醇 (β-sitosterol) 为植物甾醇类成分, 存在于各种植物油、坚果等植物种子中, 相关研究表明β-谷甾醇具有降低血清胆固醇、消炎解热、抗肿瘤及提高机体免疫力等作用。并已证明β-谷甾醇可诱导结肠癌、前列腺癌和乳腺癌细胞的凋亡。为了解β-谷甾醇对免疫细胞的影响, 我们将不同质量浓度的β-谷甾醇在体外作用于共刺激细胞, 以探讨β-谷甾醇对人共刺激细胞杀伤SGC-7901细胞的影响极其可能的机制, 以期为β-谷甾醇用于肿瘤的治疗提供理论依据和实验依据。 1 材料和方法 1.1 免疫、生化药物和仪器 β-谷甾醇 (含量98%, 本实验室制备) ;四甲基偶唑蓝 (MTT) 、二甲亚砜 (DMSO) 均购自Sigma公司;Cell Counting Kit-8 (CCK8) 购自碧云天生物技术研究所;人胃癌SGC-7901细胞株购自中国科学院上海细胞研究所;RPMI 1640培养基、小牛血清、胰蛋白酶均购自Gibco公司;淋巴细胞分离液 (中国科学院血液病研究所) ;IL-1α、IL-2、IL-18 (厦门特宝生物公司) ;IL-15和IL-21 (购自RD公司) ;CD3单抗 (上海免疫研究所) ;CD28单抗 (苏州大学生物技术研究所) ;INF-γ购于Abender公司;FITC和Per CP标记的抗人CD3、PE标记的穿孔素、颗粒酶B和APC标记的CD107a抗体, FixPerm破膜剂均购自杭州联科生物公司 (Immunotech, Franc) ;鼠抗人pERK1/2单克隆抗体, 兔抗人Bcl-2单克隆抗体均购自santa cruz公司;乳酸脱氢酶试剂盒 (日本世诺临床诊断制品株式会社) ;BCA蛋白质量浓度测定试剂盒 (碧云天生物技术研究所) ;Encore全自动生化分析仪 (购自北京希亚克技术有限公司) ;流式细胞仪 (美国BD公司) ;ABX pentra120全自动5分类血液分析仪 (法国ABX公司) 。 1.2 重组细胞的制备 取10份健康献血者外周抗凝血, 10 ml/每份, 用淋巴细胞分离液分离单个核细胞 (1 500 r/min, 离心15 min) , 吸取单个核细胞层, 生理盐水洗涤3次 (1 500 r/min离心, 10 min/次) , 用RPMI l640培养液 (含rh IFN-γ2×106U/L、100 ml/L小牛血清、50 ml/L人AB血清) 调整细胞数为5×108/L, 接种于6孔细胞培养板中, 每孔5 ml, 置37℃、5%CO2环境培养24 h, 然后加入IL-1α (10μg/L) 、rh IL-2 (5×104U/L) 、CD3 m Ab (1 mg/L) 、IL-15 (20μg/L) 、IL-18 (10μg/L) 、IL-21 (10μg/L) 、CD28 m Ab (10 mg/L) , 于37℃、5%CO2培养箱中培养, 每2天半量换培养基 (含相应的细胞因子) 1次, 并调整细胞数为5×108/L。收集培养10 d的贴壁细胞进行细胞表面标志物检测和相关实验。 1.3 细胞培养和分离 将复苏后的胃癌SGC-7901细胞放入细胞培养瓶中, 加入10 ml细胞培养液, 在37℃、5%CO2条件下培养, 2~3 d更换细胞培养液, 细胞铺满瓶底时, 0.25%的胰酶消化脱壁, 800 r/min离心3 min, 弃去上清, 收集细胞用于实验。 1.5 供标药物复孔 取对数生长期SGC-7901细胞, 配成5×108/L, 接种于96孔板中, 0.2 ml/孔, 于37℃、5%CO2培养箱中培养, 24 h后加入β-谷甾醇 (终质量浓度分别为0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40、80μg/ml) , 设不加药物的对照组及空白对照, 每组设5个复孔。继续培养48 h后加入MTT 20μl, 置于37℃、5%CO2培养箱中继续孵育4 h, 弃去上清, 每孔加入DMSO 150μl, 轻轻震荡10 min, 使沉淀产物完全溶解, 在450 nm