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动物骨骼肌肌纤维的几种不同染色方法比较 根据三磷酸酶（gdp酶）的染色，不难将腓肠肌肌腱纤维（i）分为i型和ii型。iia型为浅红色肌纤维，也称为中间快收缩纤维，iiib型为白肌纤维，也称为快收缩纤维，它们分别适用于不同的生理功能。Peter依据肌纤维的代谢特征将其分别归属于琥珀酸脱氢酶反应区分的慢缩氧化型 (SO型) 、快缩氧化糖酵解型 (FOG型) 和快缩糖酵解型 (FG型) 。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶染色技术也是国外学者用于区分骨骼肌纤维结构的重要方法之一, 该方法简便易行, 能够依据骨骼肌纤维的形态特征、生理生化、功能代谢以及组织化学反应, 也可将其分成为慢缩氧化型 (SO型) , 快缩氧化糖酵解型 (FOG型) 和快缩糖酵解型 (FG型) 三型。Fuentes也采用琥珀酸脱氢酶反应以区分肌纤维的类型。但是, 由于ATP酶活性的高低能够表明肌纤维的收缩速度, 而各种氧化酶、还原酶的活性显示出肌纤维的代谢特征。对于这3种染色方法之间是否能视为同类型的分型方法尚有待于深入的研究。显然肌纤维的分型根据生理功能、组织化学和组织结构而确定, 不同的动物肌纤维分型的形态标准也不尽相同, 但为了科学合理地通过对肌纤维的大小、分布、构成比例等做定量与定性的分析。本文尝试应用肌动球蛋白腺苷三磷酸酶即ATP酶法、琥珀酸脱氢酶即SDH酶法和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶即NADH-TR酶法在家兔的趾长伸肌上做试验, 以期寻找其规律。 1 材料和方法 1.1 %氨基甲酸乙酯麻醉 成年的健康家兔 (Oryctola-gus cuniculus domestica) 6只, 体重2.5～3 kg, 雌雄不拘, 以20%氨基甲酸乙酯腹腔麻醉 (1 g/kg体重) , 于小腿取两侧趾长伸肌, 以木块两端固定成正常状态下的肌肉长度, 立即置液氮 (-196℃) 内冷冻备用。 试剂有三羟甲基氨基甲烷等常规试剂均为国产分析纯, 氯化硝基四氮唑蓝 (NBT) 与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶 (NADH-TR) 系Fluka产品。 1.2 还原酶组织化学 标本在Leica恒冷切片箱 (德国产) 内-20℃, 制作切片, 厚10 μm, 室温下空气干燥后做肌动球蛋白腺苷三磷酸酶, 琥珀酸脱氢酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶组织化学染色。采用改良的肌动球蛋白ATP酶法, 分别在37℃ (pH 10.4) 与37℃ (pH 4.4) 孵育40 min, 硫化铵黑色沉淀为阳性反应。琥珀酸脱氢酶按Nachlas等方法, 37℃孵育30 min, 出现蓝色颗粒沉淀为阳性反应, 根据反应强弱可分为浅染FG型, 中染FOG型和深染SO型三型纤维。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑氧化还原酶, 置于孵育液中37℃下孵育30～40 min, 在胞浆内显示紫蓝色沉淀反应, 依据其反应的强弱分为深染的SO型, 中染的FOG型及浅染的FG型肌纤维。 1.3 肌纤维计数和计数 在光学显微镜 (Olympus, 日本产) 下观察肌纤维的类型、形态和结构。每张切片随机抽样20个点。放大100～200倍显微摄像, 经冲洗扩印照片后计数肌纤维, 每张照片含50～100条肌纤维, 即每张切片或每个标本共计数1 000～2 000条肌纤维。在计算各型肌纤维的构成比例的基础上, 再做统计学分析。 2 结果 2.1 肌动高尔夫球场腺苷三磷酸酶酸法ph值 在肌动球蛋白腺苷三磷酸酶碱法 (pH 10.4) 染色切片上, 趾长伸肌的肌纤维可分为Ⅰ型、ⅡA型、ⅡB型。Ⅰ型肌纤维最细, 染色浅;ⅡA型肌纤维中等, 染色深;ⅡB型肌纤维最粗, 染色居中等。而经过肌动球蛋白腺苷三磷酸酶酸法 (pH 4.4) 染色切片上能分出深染呈黑色的直径小的Ⅰ型纤维, 浅染而直径中等的ⅡA型纤维及呈褐色的直径最大的ⅡB型纤维 (图1、2) 。家兔的肌纤维构成比例是Ⅰ型 (SO型) 染色, ⅡA型 (FOG型) 染色, ⅡB型 (FG型) 染色, 故ⅡBⅡAⅠ型纤维, 统计学分析有极显著差异,P0.01 (见表1) 。 2.2 不同类型肌纤维的染色 在琥珀酸脱氢酶染色切片上, 肌纤维显蔚蓝色, 可分为浅染FG型, 中染FOG型和深染SO三型。浅染FG型纤维颗粒细小, 染色较淡, 分布均匀;中染FOG型纤维染色颗粒大小不等, 横切面上呈现周边染色较深, 中央区域染色较浅;深染SO型纤维染色颗粒较大, 染色较深, 也呈现周边深, 中间浅的特点。三型肌纤维呈现镶嵌交叉排列, 横切面呈现多边形或椭圆形 (图3) 。在家兔中浅染FG型, 中染FOG型和深染SO型纤维分别约占50%, 32%和18%。统计学分析有极显著差异,P0.01 (见表1) 。横切面深染SO型纤维较小, 中染FOG型纤维中等, 浅染FG型纤维最大。 2.