第六章克隆基因的表达.pptVIP

优选第六章克隆基因的表达 当前第1页\共有35页\编于星期五\10点 一. 原核生物基因表达的特点 ① 原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 ② 原核生物的表达是以操纵子为单位的。操纵子是数个相关的结构基因及其调控区的结合，是一个基因表达的协同单位。调控区主要分为三个部分：操纵子(operator)、启动子(promotor)及其他有调控功能的部位。 当前第2页\共有35页\编于星期五\10点 ③ 由于原核生物无核膜，所以转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。 原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，转录成mRNA后，可直接在胞浆中与核糖体结合翻译形成蛋白质。在翻译过程中，mRNA可与一定数目的核糖体结合形成多核糖体。两个核糖体之间有一定长度的间隔，为裸露的mRNA。每个核糖体可独立完成一条肽链的合成，即这种多核糖体可以同时在一条mRNA链上合成多条肽链，大大提高了翻译效率。 当前第3页\共有35页\编于星期五\10点 ④ 原核基因一般不含有内含子(intron)，在原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。因此当克隆的含有内含子的真核基因在原核细胞中转录成mRNA前体后，其中内含子部分不能被切除。 ⑤ 原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物的直接控制要慢。对RNA合成的控制有两种方式，一是起始控制(启动子控制)，二是终止控制(衰减子控制)。 当前第4页\共有35页\编于星期五\10点 ⑥ 在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同16S核糖体RNA 3’末端碱基互补的序列，即SD序列，而真核基因则缺乏此序列。 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由 3~9bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3’末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。 当前第5页\共有35页\编于星期五\10点 因此，欲将外源基因在原核细胞中表达，必须满足以下条件： ① 通过表达载体将外源基因导人宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白； ② 外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA； 当前第6页\共有35页\编于星期五\10点 ③ 必须利用原核细胞的强启动子和S-D序列等调控元件控制外源基因的表达； ④ 外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(open reading frame，ORF)； ⑤ 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。 当前第7页\共有35页\编于星期五\10点 二. 基因表达的调控序列 如上所述，由于原核和真核细胞中基因表达的机制是不同的，因此必须详细了解基因表达过程中的各种调控因子，构建高效的表达载体，才能达到高效率、高水平表达外源基因的目的。对原核生物来讲，基因表达的调控序列主要涉及启动子、S-D序列、终止子、衰减子等序列。 当前第8页\共有35页\编于星期五\10点 1．启动子(promotor) 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，没有启动子，基因就不能转录。启动子有两个保守区： （1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游5—10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。 （2）—35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称—35区，一般由10个碱基组成。 当前第9页\共有35页\编于星期五\10点 启动子有强弱之分，虽然原核细胞仅靠一种RNA聚合酶就能负责所有RNA的合成，但它却不能识别真核基因的启动子。为了表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才在原核表达系统中被转录。 在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac (乳糖启动子)、trp (色氨酸启动子)、PL和PR(λ噬菌体的左向和右向启动子)以及tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。 当前第10页\共有35页\编于星期五\10点 2．S-D序列 mRNA在细菌中的转译效率依赖于是否有核糖体结合位点的存在，即S-D序列以及S-D序列与起始密码子AUG之间的距离。在原核细胞中，当mRNA结合到核糖体上后，翻译或多或少会自动发生。细菌在翻译水平上的调控是不严格的，只有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。