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重组胶原蛋白透皮吸收测定方法 1 范围 本文件提供了化妆品领域用重组胶原蛋白原料透皮吸收的定性和定量分析方法。 本文件适用于定性或定量评价化妆品领域用重组胶原蛋白原料透皮吸收的能力。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T27818 化学品 皮肤吸收 体外试验方法 YY/T 1849 重组胶原蛋白 《中华人民共和国药典》 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 重组胶原蛋白 recombinant collagen 采用重组DNA技术，对编码所需人胶原蛋白质的基因进行遗传操作和 （或）修饰，利用质粒或病 毒载体将目的基因带入适当的宿主细胞 （细菌、酵母或其他真核细胞等）中，表达并翻译成胶原蛋白或 类似胶原蛋白的多肽，经过提取和纯化等步骤制备而成。 [来源：YY/T 1849,3.2] 4 定性定量方法 4.1 基本要求 本文件给出了用于重组胶原蛋白透皮吸收的定性分析方法和相对定量分析方法。宜先进行定性分析， 其结果为有透皮吸收的情况时再进行定量分析；若定性分析结果没有透皮吸收则没有必要进行定量分析。 4.2 定性方法——荧光标记法 4.2.1 原理 异硫氰酸荧光素 （Fluorescein isothiocyanate，FITC）被广泛用于在蛋白质氨基上附加荧光标签。当 FITC在碱性溶液中与蛋白质反应时，异硫氰酸酯基团与蛋白游离的伯氨基反应，形成FITC-蛋白质结合 物，在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光，发射波长为 525nm，激发波长为 495nm， 通过在荧光显微镜下观察对相应蛋白进行定性、定位分析。本文件依据FITC标记蛋白的原理对重组胶 原蛋白进行标记，以评价重组胶原蛋白的透皮吸收特性。 4.2.2 试剂、材料、仪器和设备 1 所用试剂均为分析纯。 a）试剂和材料如下： 1）FITC； 2）碳酸钠； 3）碳酸氢钠； 4）二甲基亚砜 （DMSO）； 5）氯化铵 （NH Cl）； 4 6）市售脱毛膏； 7）试验动物：白化豚鼠或SD 大鼠，雌雄不限，周龄为8周，体重250g~300g。 注：若选择其他皮肤模型如组织工程3D皮肤等需自行验证。 b）仪器和设备如下： 1）分析天平，感量0.0001g； 2）凝胶色谱分离柱； 注：根据重组胶原蛋白的分子量大小选择合适孔径填料的色谱柱。 3）蛋白纯化系统； 4）宠物电推剪； 5）冷冻切片机； 6）荧光倒置显微镜。 4.2.3 重组胶原蛋白-FITC标记物的制备 4.2.3.1 溶液配制 溶液配制如下： a） 碳酸钠缓冲液 （0.1M，pH 9.0）：称取0.106g 无水碳酸钠、0.756g碳酸氢钠加水溶解，调 pH 至9.0，定容至 100mL 备用 （现配现用）； b） FITC 溶液：溶解FITC 于无水DMSO 中，配制成1mg/mL 的溶液，体积为1.5mL； c）NH Cl 溶液（1M）：称取0.535gNH Cl 加0.1M 碳酸钠缓冲液（pH 9.0）溶解，定容至10mL。 4 4 4.2.3.2 试验步骤 具体试验操作可同时参考所使用的FITC 使用说明书 （如索莱宝的FITC），主要步骤如下： a） 用碳酸钠缓冲液 （0.1M，pH 9.0）配制重组胶原蛋白溶液，浓度≥2mg/mL，体积为20mL； b） 按1mL 重组胶原蛋白溶液加入50 μLFITC 溶液的比例，将FITC 少量多次 （每次5μL）加入 至重组胶原蛋白溶液中，边加边轻轻搅拌； 注1：按照重组胶原蛋白的氨基酸序列，FITC 与重组胶原蛋白中伯氨基的摩尔比需1.0，FITC 需过量。 注2：反应体系 （20mL）可根据实际需要