不同破壁方法提取黄酒麦曲中微生物总dna的比较研究.docxVIP

不同破壁方法提取黄酒麦曲中微生物总dna的比较研究 黄酒是中国的特产，享有“国酒”的美誉。黄酒的工艺、品种、口味历经千百年的历史沉积和文化锤炼才逐步形成了今天独具一格的魅力和神韵,是低粮耗、低酒精度、高营养的酿造酒,是提倡发展的酒种,符合酒类市场低度、营养、保健的消费趋势。以麦制曲、用曲酿酒是中国黄酒的特色,也是传统操作技艺,享有“酒之骨”之称。 传统麦曲在黄酒中既是糖化发酵的粗酶制剂,又作为少量酿酒原料和营养物质保留在黄酒中。麦曲中蕴含着一个非常复杂的混合微生物体系,在制曲过程中大量生长,产生各种酶类,为黄酒的发酵提供必需的酶类。传统的方法研究麦曲中微生物具有很大的局限性:一是麦曲中的一些不可培养的微生物不能得到有效分离。二是只能静态地研究麦曲中的微生物,不能动态地研究制曲过程中微生物的生长变化过程。所以,传统方法无法弄清制曲过程中麦曲微生物生长变化情况。分子生物技术在混合微生物研究体系中的应用,极大地方便了动态研究微生物种群结构变化的情况,能够用来了解麦曲的微生物区系和种群数量,在认识微生物群落的动态变化上具有重要的作用。 微生物分子生态学是通过分析样品中DNA分子的种类、数量等基因组信息来反映样品中微生物细胞的种类与种群比例等信息。它克服了培养方法的局限性,直接对环境样品中的微生物基因组DNA的组成状况进行分析评价,所以,样品总DNA的提取是研究的前提条件和关键,可靠、高效的混合样总DNA提取方法非常重要。通常,评价一种DNA提取方法的好坏主要从5个方面考虑:(1)所得DNA具备理想的纯度;(2)DNA要足够完整,破损程度小;(3)DNA的量要充足;(4)PCR扩增产物条带数尽可能多;(5)方法尽可能简便、省时、费用低。麦曲样品中成分复杂,提取麦曲样品总DNA用于分析其中微生物的多样性时,不仅要最大限度地提取到每个物种的DNA,而且要保证片断足够大,杂质少。如果用温和的提取方法进行提取,固然可以得到大片段的DNA,但又不能保证使样品中绝大多数的微生物破壁,会降低结果中的微生物多样性,而用剧烈的提取方法,能将绝大多数的微生物破壁,但往往使大量DNA被剪切,从而使得到的DNA没有分析价值。本文采用物理法(超声波)、酶法(Yatalase酶)、化学法(氯化苄)对黄酒麦曲样品进行破壁,提取微生物总DNA,并通过细胞裂解率、DNA的纯度、片段的分布情况、ITS(内转录间隔区)序列扩增产物的多态性来评估不同的破壁方法对麦曲样品总DNA提取效果的影响,确定一种合适的破壁方法来提取麦曲总DNA。 1 材料和方法 1.1 材料和样品的预处理 1.1.1 材料表面 黄酒麦曲样品由黄酒公司提供。取样后立即保存于4℃,并于48h内抽提DNA;纯种微生物(米曲霉和酵母)为本实验室保藏菌种。 1.1.2 悬浮液悬浮液制备 无菌条件下,将粉碎好的麦曲加入带玻璃珠的三角瓶中,加入无菌生理盐水洗涤麦曲,将悬浮液滤纸过滤后,滤液经离心收集沉淀,4℃保存备用。取适量无菌生理盐水洗涤纯种微生物的斜面,收集菌液,4℃保存备用。 1.2 不同的分解方法，不同的麦曲样品 1.2.1 超声波处理 根据Picard等方法改进。取样品200 mg,加入3mL提取液(0.1mol/L Tris-HCl,p H 8.0;0.15 mol/L EDTA,p H8.0)振荡混匀,加入0.9m L10%SDS后,超声波(600W)在4℃冰浴下处理10 min。离心,上清液0℃保存备用。 1.2.2 so4-3-1h42so4的制备 取样品200 mg,加入3 m L苹果酸缓冲液(p H5.5)振荡混匀,加入2%Yatalase(Ta Ka Ra,上海)和终浓度为0.6 mol/L的(NH4)2SO4,30℃保温4h,每10 min上下颠倒混匀。加入0.2倍体积的石英砂,剧烈振荡2min,离心,上清液0℃保存备用。 1.2.3 酶处理过滤法 根据朱衡等方法改进。取样品200 mg,加入2m L提取液(0.1mol/L Tris-HCl,p H 8.0;0.15 mol/L EDTA,p H8.0)振荡混匀,加入0.6 mL 10%SDS、3 m L氯化苄和0.2倍体积的石英砂,剧烈振荡混匀。50℃保温1h,每隔10 min振荡混匀1次。加入1.5 mL 3mol/L醋酸钠(p H5.2),冰上放置15 min,离心,上清液0℃保存备用。 1.3 -羟基苯磺酸te的制备 取保存的上清液,加入0.1倍体积3 mol/L的醋酸钠和0.6倍体积的异丙醇,冰上沉淀5 min,10000 r/min离心,沉淀用200μL TE溶解,加入适量RNAase,65℃水浴15 min,加入200μL苯酚-氯仿(苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1)抽提至界面无可见物,取200μL上清液加入氯仿:异戊醇(