人骨肉瘤细胞mg63中foxm1基因表达及对细胞增殖与凋亡的影响.docxVIP

人骨肉瘤细胞mg63中foxm1基因表达及对细胞增殖与凋亡的影响 中国肿瘤防治杂志，2014年21（20）：1575-1579。 骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤, 其恶性程度高, 血行转移发生早, 具有较高的局部浸润和早期转移倾向, 是导致患者死亡最主要的原因。Forkhead box M1 (FoxM1) 是叉头框转录因子家族成员之一, 基因定位于12p13-3, 长约23kb, 普遍表达于增殖活跃的细胞, 与DNA损伤修复、组织稳态及细胞凋亡等过程密切相关。近年来研究表明, FoxM1在多种恶性肿瘤中均存在高表达, 其中包括肺癌、乳腺癌和前列腺癌等。FoxM1在人骨肉瘤中亦存在高表达现象。本研究以特异性siRNA干扰骨肉瘤细胞株FoxM1表达, 观察其对细胞增殖与凋亡的影响, 初步在细胞与分子水平了解FoxM1调控细胞增殖与凋亡的机制。 1 材料和方法 1.1 试验兔抗兔模型 人骨肉瘤细胞株MG63和SOSP-9607由第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所保存。MEM和RPMI1640培养基购于美国Corning公司, 胎牛血清购于美国Gibco, 胰蛋白酶和四甲基偶氮唑盐 (MTT) 购于美国Sigma公司, LipofectamineTM2000购于美国Invitrogen公司, 二甲基亚砜 (DMSO) 购于美国Ventec公司, 酶标仪 (Bio-Rad 680, USA) , 低温离心机 (Beckman, USA) ;兔抗人FoxM1、β-actin (CST, USA) HRP标记羊抗兔IgG购于美国Pierce公司, Total RNA KitⅡ购于美国OMEGA公司, PrimeScript RT reagent kit、Real time PCR kit购于日本TaKaRa公司, FOXM1-siRNA及阴性对照siRNA序列由上海吉玛公司合成。流式细胞术检测在第四军医大学基础部免疫学教研室进行。 1.2 细胞培养及转染 MG63和SOSP-9607细胞分别培养于含10%胎牛血清的MEM和RPMI1640培养基中, 置于37℃、5%CO2中传代培养, 并取对数生长期的细胞用于实验。 1.3 sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳 取生长状态良好的MG63和SOSP-9607细胞, 冰上裂解细胞提取总蛋白并BCA法进行定量, 调整样品浓度。上样30g/孔, 行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 100V湿转90min;含5%脱脂奶粉的TBST液封闭2h;抗FoxM1和抗β-actin 4℃孵育过夜, 相应二抗室温2h;洗涤后ECL显色, 置入仪器观察, 拍照记录。 1.4 g膜转染及细胞培养 针对FoxM1的特异性siRNA正义链为5′-GGA-CCACUUUCCCUACUUUTT-3′, 反义链为5′-AAA-GUAGGGAAAGUGGUCCTT-3′;阴性对照序列正义链为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′, 反义链为5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。转染前将MG63细胞以每孔1×105的密度接种于6孔板中培养, 待细胞处于对数生长期并且融合度达60%时进行转染。将MG63细胞分为实验组、阴性对照组和空白对照组, 前两者分别转染特异性siRNA和阴性对照siRNA, 空白对照组细胞不处理, 每组设3个复孔。转染时以Opti-MEM无血清培养基稀释siRNA序列与LipofectaminTM2000, 参照LipofectaminTM2000说明书进行, 转染终体积为2 mL/孔, siRNA转染浓度为100nmol/L, 转染后8h换液, 添加含胎牛血清10%的培养基。实验重复3次。 1.5 rt-pcr检测 于转染后72h收集各实验组细胞, 提取总RNA, 采用SYBR GreenⅠ染料法检测各组细胞FoxM1基因表达水平。FoxM1基因PCR引物序列上游为5′-G-AAGAACTCCATCCGCCACA-3′, 下游为5′-GCCT-TAAACACCTGGTCCAATGTC-3′;β-actin引物序列上游为5′-TGGCATTGTTACCAACTGGGTC-3′, 下游为5′-TCACGGTTGGCCTTAGGGTTC-3′。按荧光实时定量RT-PCR试剂盒说明书进行, PCR反应条件94℃预变性6 min, 95℃变性10s, 60℃退火1min, 共进行40个循环;循环结束后71℃保温30s, 所得结果进行读数分析。采用相对定量法, 分析实验组、阴性对照组及空白对照组细胞转染48h后的ΔCt值, 计算ΔΔCt, 进而换算为2-ΔΔCt(设空白对照组表达量为1) , 即为转染48h后各组FoxM1相对表达量。 1.6 总蛋白的提取 采用蛋白质印迹法检测。转染后72h收集