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ph值对转基因鱼腥藻培养的影响 本研究建立了一个新的实际视觉系统，通过转移tnf诱导反应，为山羊的生产创造了新的、实用的视觉系统。这项研究的成功具有广阔的前景。实验已证实含蔗糖9g/L,硝酸钠2.25g/L的BG-11培养基适于转基因鱼腥藻培养,本文对转基因鱼腥藻混合营养型培养过程pH的影响进行了研究,为转基因鱼腥藻生产人肿瘤坏死因子打下基础。 1 材料和方法 1.1 藻类 转基因鱼腥藻7120(Anabaena sp. PCC7120,pDC-TNF)由广州军区陆军总医院医学实验中心提供。 1.2 新霉素g-11培养液 培养基采用蔗糖含量9g/L,硝酸钠含量2.25g/L,含新霉素25μg/mL的BG-11培养液,120℃蒸汽灭菌20min,灭菌后加入新霉素。 1.3 培训条件 悬浮培养条件:旋转式摇床转速110r/min,全天光照,100mL锥形瓶装液50mL培养。 1.4 测定生物量及可溶性蛋白 每种维生素各浓度平行3个样,同时作对照实验,t检验法检验显著性。 生物量测定用干重法和比浊法。可溶性蛋白含量测定用考马斯亮蓝法。TNF-α表达量测定用SDS,将图谱用凝胶成像系统扫描,可得TNF表达百分含量。 2 结果与讨论 2.1 初始ph值对认识流转鱼腥藻tnf的影响 从表5-7可知,培养基具有较强的缓冲能力,灭菌前调节培养基的pH值几乎没有意义。 灭菌后调节pH值对生长也影响不大,从不同初始pH值培养过程可知,pH的变化(表2)虽在培养之初极短的一段时间有差别,但在培养初期很快上升,第3d以后的整个过程均维持在10附近,不同初始pH变化没有显著区别(tt0.10,4)。各初始pH值下的生长速率及最终生物量比较接近(表3),初始pH为4.4、6.4、8.3之间没有显著差异(tt0.10,4),但pH9.9时不利影响显著(tt0.05,4),可见初始pH不能太高,应控制在4.4~8.3。但一般微藻生长在微碱性环境中,转基因鱼腥藻培养过程的pH值相对较高,从生长过程也发现初始pH值对开始时的生长速率有影响,如果在培养过程中维持适合的pH值,可望促进转基因鱼腥藻的生长。 从外源基因表达水平看(表3),各初始pH值下也比较接近,根据方差分析,pH6.4与8.3下的TNF表达水平没有显著差异(tt0.10,4),但它们与pH4.4及9.9下的TNF表达水平差异显著(tt0.05,4),说明pH值太高或太低都不利于TNF的表达。根据实验结果,培养基初始pH以自然pH8.3为宜。 2.2 ph对转基因鱼腥藻生长的影响 根据上述实验结果,调节培养过程pH值可能会影响转基因鱼腥藻的生长和表达。一般微藻适合在弱碱性环境中生长,实验采用流加稀盐酸控制培养过程的pH值分别为8.5和9.0(图2),每隔一天进行间歇流加稀盐酸得到生长曲线(图3)。 从生长曲线看,培养5d后,生物量的差别明显,从表4可知,流加稀盐酸控制pH显著(tt0.05,4)提高了15d的生物量,pH9.0和8.5分别比未流加盐酸提高8.18%和12.41%。 调节培养过程pH对外源基因表达水平(表4)的影响不显著(tt0.1,4),可以认为在三种实验条件下TNF表达水平保持稳定。TNF在pH大于10时易失活,因此控制pH有可能能更好地保持TNF-α的活性。 从流加过程pH变化过程看(图2),pH值在一天中又上升到较高水平,因此不断调节pH的过程,实际上也是转基因鱼腥藻不断适应新环境的过程,尽如如此,调节pH后仍旧显著促进了转基因鱼腥藻的生长,调节pH8.5,在生长过程中其生物量一直比调节pH9.0的高。可见在转基因鱼腥藻培养中隔天流加稀盐酸控制过程pH8.5对转基因鱼腥藻的生长最有利,又不影响外源基因的表达,是一种合适的流加方法。 如果在生产过程中自动控制pH,减少扰动,可望更大地提高收获生物量。 3 初始ph值对转基因鱼腥藻生长的影响 培养基初始pH值影响不大,初始pH4.4~8.3,转基因鱼腥藻7120的生长没有显著区别,但pH太高与太低均不利于外源基因表达,初始pH以自然pH8.3为宜。 间歇流加稀盐酸控制过程pH值为8.5和9.0显著促进转基因鱼腥藻生长。培养过程每24h流加稀盐酸一次,控制pH8.5对转基因鱼腥藻生长最有利,该条件下15d生物量大于3g/L,比未流加增长12.41%,可溶性蛋白为0.3g/g藻干重,TNF表达量超过22%,TNF表达量保持原有水平。