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3-np对运动大鼠纹状体的保护作用 事实上，条纹体包括身体的学习记忆、感觉感知、运动和协调机。此外，hd（hunterondisease）不独立舞蹈样的运动、神经精神障碍和认知功能的降低明显与线条体的机械作用有关。临床和实验表明，hd的病理变化明显伴有着条纹体。兴奋毒性损害机制牵涉人类HD的发生和发展过程,喹啉酸(quinolinic acid,QA)为其实验研究的典型动物模型;其为谷氨酸类似物和NMDA受体激动剂,通过促进皮质神经元谷氨酸的释放和干扰谷氨酸的重吸收选择性地作用纹状体神经元。而另一假说是HD时神经元线粒体代谢机能障碍牵涉到琥珀酸脱氢酶,此能量代谢损害激发NMDA受体过度激活,进而导致细胞内钙超载和神经元死亡。因此,琥珀酸脱氢酶抑制剂3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid,3-NP)作为HD能量代谢障碍机制方面的实验研究模型。综观目前HD的实验研究,在形态学方面仍有许多尚待证实的问题,包括纹状体损害的定位、神经元损伤的类型和性质的确切鉴定。为此,本研究以3-NP作为实验动物模型探测证实3-NP诱导实验大鼠的运动行为学变化,组织学证实3NP导致纹状体损害的部位,以及纹状体不同类型神经元对3NP损害的敏感特异性,为全面认识HD的病理机制提供形态学资料。 1 材料和方法 1.1 动物分组、给药和输注 正常雄性成年SD大鼠20只,体质量250～300 g(中山大学实验动物中心提供)。3-NP(Sigma,12.5 mg/mL,生理盐水配制)腹腔注射(20mg·kg-1·d-1),2次/d,连续给药5 d。大鼠完成给药12 h后处死。用于组化和免疫组化染色的动物,用25%水合氯醛腹腔注射麻醉(2.7 mL/kg体重),经过心脏快速灌注0.9%生理盐水400 mL,继用4%多聚甲醛(0.1 mol/L PB配制,pH 7.4)400 mL灌注固定。常规取脑后浸于20%蔗糖(含4%多聚甲醛)中,4℃,直至沉底。半导体冰冻系列切片(厚40μm),备用于各种组织学染色。 1.2 前嘴唇停留时间的测定 于3-NP处理前5 d至注射后5 d(共计10 d),实验大鼠分别进行握力测试和平衡木测试。握力测试:在厚的泡沫垫上空50 cm处悬挂一根长35 cm、粗2 mm的钢丝,记录大鼠前爪在上面悬挂的时间。一天测试两次,共10 d。平衡木测试:让大鼠从平衡木(长120 cm,宽7 cm,离地面35 cm处)的一端走到另一端的食物箱内(24.5 cm×20.0 cm×18.0 cm),每天测试3次,共10 d。记录大鼠前进之前的停留时间(启动延搁时间,包括大鼠被放到平衡木起点到开始前进20 cm的时间间隔),通过全程的时间(从大鼠被放到平衡木起点到鼻子刚好进入暗箱的时间间隔),以及前爪滑落的次数(即footslips,前爪低于平衡木表面以下1.5 cm的次数)。如果大鼠落下或时间超过3 min即为未完成。 1.3 免疫组化 1.3.1 sl组化染色 取5只动物脑块按照常规步骤进行切片HE和Nissl组化染色。Tunel染色严格按照In Situ Cell Death Detection Kit,POD(Roche)试剂说明书步骤进行。 1.3.2 切片处理与形片制备 取5只动物,用0.9%生理盐水灌注,快速取脑,置于新鲜配制的Golgi-cox溶液中,室温,避光浸泡14 d。转入30%蔗糖,室温,避光浸泡3～5 d。振动切片,收集于70%酒精中,裱片,晾干。DW洗1 min,28%氨水1∶1(in双蒸水)避光30 min,双蒸水洗1 min,避光放置30min,梯度酒精脱水,透明,封片。 1.3.3 恒冷切片、烘干 取5只动物,用冷PBS(含10%甘油)灌注,快速取脑,恒冷切片。裱片,晾干。用0.3%mmol/L NBT,0.05 mol PB和0.05M/L琥珀酸钠混合液染色,37℃,30 min。室温晾干,脱水,透明,封片。 1.3.4 小鼠和兔darpp32表达对药敏试验 取5只动物脑切片。步骤如下:(1)0.1 mol/L PB(pH 7.4)洗3次;(2)0.3%双氧水(0.1 mol/L PB,pH 7.4),室温,30 min;(3)小鼠单克隆抗NeuN抗体(1∶500,Chemicon公司),兔多克隆抗Darpp32抗体(1∶250,Cell Signaling公司),4℃,36 h;(4)相应的抗小鼠或抗兔IgG(1∶100,Sigma公司),室温,3 h;(5)相应的小鼠或兔PAP(1∶200,Sigma公司),室温,2 h;(6)DAB-H2O2显色2～8 min。各步骤之间用0.1mol/L PB(pH 7.4)洗3次,每次5 min。在完成显色之后进行裱片,常规脱水、透明、封片。 1.4 统计处理