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利用双对数制作酶动力学米氏常数和最大反应速率 在酶动力学中，随着温度、phh和酶浓度的稳定，物壤浓度对酶的促进反应速度有显著影响。在底物浓度很低时,酶促反应的速度随底物浓度的增加而迅速增加;随着底物浓度的继续增加,反应速度的增加开始减慢;当底物浓度增加到某种程度时,反应速度达到一个极限值Vmax。 Vmax是酶的一个基本特征常数,它包含着酶与底物结合和解离的性质。从酶动力学米氏方程式可知,米氏常数Km等于反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度,米氏常数的单位就是浓度单位,mol/L。Km与底物浓度、酶浓度无关,与p H、温度、离子强度等因素有关。对于每一个酶促反应,在一定条件下都有其特定的值,因此可用于鉴别酶。 1 双固相转移的双培养方程法 目前测定Km和Vmax,一般仍用作图法。作图法有很多种,最常用的是双倒数方程作图法,又称双倒数作图法,该法是根据米氏方程的倒数形式,以1/ν对1/[S]作图,可得到一条直线,如图1所示。其中直线在横轴上的截距为-1/Km,纵截距为1/Vmax,据此可求Km和Vmax。双倒数方程的表达式如式(1)所示。 其中,ν为反应速度,Km为米氏常数,Vmax为酶反应最大速度,[S]为底物浓度。 2 算法求解步骤 酶动力学分析模块(Enzyme Kinetics Module)是基于Sigma Plot(著名绘图软件)上开发的专业针对酶动力学的分析模块。本文使用的这两个软件版本是Enzyme Kinetics Module 1.1(SPSS公司产品)和Sigma Plot 2000 v6.1(Systat公司产品),软件是从产品公司官网上下载的30天试用版。 酶动力学分析模块联合Sigma Plot绘图软件求解Km和Vmax步骤如下: 1)在操作系统上先安装Sigma Plot 2000后再安装EKM,安装最好选择系统盘。 2)先运行Sigma Plot 2000再运行EKM,出现酶动力学分析数据输入向导,按向导手动一步步选择:底物、底物-抑制剂或底物-激活剂→底物浓度和反应速率单位→输入底物浓度和反应速率一组数值→选择数据处理模型和图像分析模型→输出数据分析报告项目选择→完成(Finish),EKM数据输入向导关闭。 3)Sigma Plot界面上生成数据报告窗口,界面左栏上选择点线图后,弹出制图向导,手动选择如下:依据上步选择的图像分析模型定制XY轴→完成(Finish);制图向导关闭,生成图像窗口。注意:XY轴定制完全依据上步图像分析模型的选择情况。举例说明,上步选择米氏方程后,XY轴的选项中只出现底物浓度和速率选项,将浓度分配给X,速率分配给Y;如想将浓度倒数分配给X,需重新打开EKM向导,在图像分析模型一步中选择双倒数方程等其他方程。 4)完成一组数据的分析后,若希望下次打开后各窗口内容完整保存,须将该任务存档为.jnb文件。个人使用经验:因多数情况下,仅需要曲线图,Km、Vmax和数据拟合的相关系数,可以将上述结果导出到一个.doc文档内。 3 酶动力学模块用于解决行程和vmx的问题 3.1 氨气体积分数与氨氮数目的核算 为了科学准确地反映底物浓度、反应速率与米氏方程中米氏常数Km和最大反应速率Vmax之间的关系,选择了两套底物浓度范围:0.02 mol/L~0.20 mol/L和0.20 mol/L~2.00 mol/L。氨气体积分数与氨氮数目的换算公式如下: 1 ppt·s-1=10-6ppm·s-1=10-6m L·m-3(大气)·s-1(2) 氨氮数(NH3-N)=氨(NH3)×14÷17(3) 遵循氮(N)物质的量守恒原则:脲酶水解反应发生瓶体积2 L,气态氨密度/大气密度=0.6,大气密度=1.293 g/L。依据式(2)和式(3)准备数据,处理后的数据如表1和表2所示。 3.2 数据输入和绘制数据图 将表1和表2中底物浓度与反应速率的数据先后分四次在EKM数据输入向导引导下完成数据输入并自动生成数据分析报告,并在Sigma Plot绘图向导引导下绘制米氏方程图,保存数据分析报告和相关图像。 3.3 利用第二组数据的方法 计算结果的报告如图2a~图2d所示。其中,图2a利用的是表1第一组数据,图2b利用的是表1第二组数据,图2c利用的是表2第一组数据,图2d利用的是表2第二组数据。另外,采用双倒数作图法对表1和表2中数据进行处理、绘图并计算出Km和Vmax,然后将作图法和酶动力学模块法得到的Km和Vmax分别列表对比,如表3和表4所示。 4 运行ekm软件后注意量纲的设置 1)向酶动力学分析模块录入数据前,需要对数据进行换算,使用Microsoft Office Excel可批量处理数据换算。 2)注意量纲的选择。运行EKM软件后,要先设置一些常规项,此时要特别注意量纲的选择