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酵母表达载体pak4的克隆及验证 接下来，我们研究了皇家遗传因子遗传因素的转移和调节。是一种直接检测细胞内蛋白质与蛋白质相互作用的遗传学方法。它接近于体内环境,可检测到瞬时,不稳定的相互作用,且不受内源性蛋白质表达干扰。 P21活化激酶(P21-activated kinase,Pak)是一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,为Rho家族小鸟苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42/Rac下游主要靶蛋白,参与许多重要细胞活动。到目前为止Pak家族共有6个成员,皆含有氨基末端(N-末端)调节区和羧基末端(C-末端)激酶区。根据其结构,将它们分为两类,I类包括Pak1,2,3,II类包括Pak4,5,6。两类Pak在结构、活化方式、生物学功能上有着很大区别,它们具有不同的下游靶蛋白。 Pak4是II类Pak中发现最早,研究较多的蛋白。国外学者报道与Pak4相互作用的靶蛋白有整合蛋白αvβ5,角质细胞生长因子受体KGFR,slingshot,PDZ RhoGEF等,与细胞黏连、细胞迁移及恶性转化有关。但是仍有许多尚未发现的Pak4相互作用蛋白。本实验利用酵母双杂交系统,从人胎脑c DNA文库中筛选Pak4新的相互作用蛋白,为进一步研究其生物学特性打下基础。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 人胎脑部门自身细菌株 大肠杆菌DH5α、表达载体pG-BKT7,p GADT7,人胎脑Matchmaker c DNA文库、酵母菌株AH109,Y187购自Clontech公司。 1.1.2 培养基和蛋白 DNA重组所用各种酶购自NEB公司、胶回收纯化试剂盒购自Takara公司、LB培养基胰化蛋白胨和酵母提取物购自Oxoil公司、X-a-Gal购自Clontech公司、酵母SD培养基、DO/-Trp、DO/-Leu、DO/-Trp/-Leu、DO/-Trp/-Leu/-His、DO/-Trp/-Leu/-His/-Ade、鲑精DNA购自BD公司、半硫酸腺苷、三氨基三唑(3-amino-1,2,4-triazole,3-AT)、Lyticase、玻璃珠购自Sigma公司、酵母YPDA培养基的蛋白胨购自BBI公司。 1.2 方法 1.2.1 pak4激酶域下游引物的筛选 以p CDNA3.1-Pak4为模板,设计了含有Nde I和Bam H I两个酶切位点的引物。Pak4激酶域上游引物为5′-GATGCTGGCAGGCGGCGGATCCTTG-GC-3′,下游引物为5′-GACCCCCGCTCCCATATG-GACAACTTC-3′。PCR扩增Pak4激酶域,定向亚克隆到酵母载体pGBKT7中,酶切鉴定、测序验证。 1.2.2 总蛋白的提取 PEG/Li AC方法将重组质粒pGBKT7-Pak4 KD转化到酵母菌AH109和Y187中,实验按Clontech公司提供的操作手册进行。转化酵母菌涂于SD/-Trp平皿上,30℃倒置生长4~6 d。挑取2~3mm大小转化菌落到液体SD/-Trp培养基中振荡过夜培养,提取酵母总蛋白,操作步骤按Clontech公司提供的说明书进行。在p GBKT7载体的多克隆位点上游融合了myc基因,我们应用鼠抗人α-myc单克隆抗体进行Western blotting检测融合蛋白的表达。 1.2.3 pak4相互作用蛋白的筛选 按照Clontech公司提供的酵母双杂交系统说明书BD MatchmakerTM Pretransformed Libraries User Manual PT#3183-1进行Mating法筛选Pak4相互作用蛋白质。将c DNA文库转化到酵母Y187,再将p GBKT7-Pak4 KD重组质粒转化到AH109,在2×YPDA酵母培养基中30℃缓慢振荡孵育24 h,将杂交菌液涂于50个SD/-Trp/-Leu培养皿上,测定Mating效率和Mating克隆数以确保筛选文库规模,再将生长的转化子挑到SD/-Leu/-Trp/-His培养皿上,30℃培养3~6 d,挑选淡粉色、直径大于2 mm,生长旺盛的His+转化子,重复在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-gal培养筛选,挑取Lac Z+蓝色菌落。 1.2.4 质粒电转、碱裂解法提取外源基因片段 用Lyticase酶裂解酵母菌株,提取酵母质粒。将质粒电转到感受态DH5α中,挑取电转单克隆菌落,碱裂解法提取质粒,用Bgl II酶切质粒鉴定外源基因片段大小。 2 结果 2.1 pak4磷酸化区域的构建 Pak4全长为1~592个氨基酸,326-572氨基酸为C末端激酶域(Pak4 KD),该区域是Pak4重要的磷酸化区域,但目前在此区域研究报道较少,我们通过构建Pak4的酵母表达载体,筛选跟这一区域结合的蛋白质。P