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实验四
根癌农杆菌介导的植物遗传转化
一实验目的
·掌握植物遗传转化的方法、理论
·掌握根癌农杆菌介导的植物遗传转化技术。
二实验原理
·农杆菌介导法转基因技术的关键是T-DNA整合受体
植物基因组的过程，这一过程依赖与Ti质粒上的T-
DNA区，和Vir区各种基因的表达以及一系列蛋白质
和核酸的相互作用
·植物细胞在受伤后细胞壁破裂，创伤分子诱导农杆
菌Vir区各种基因的激活和表达，导致T-DNA被剪切
杆菌和植物细胞的细胞膜，细胞壁进入植胞内，T-
复合体上的核靶向序列可引导T-DNA整合到植物基
因组
三材料与用品
1、实验材料：棉花材料YZ1无菌苗)
农杆菌菌株EHA105
MCS
LB Bt nos3 nos3 nptlI nos5 RB
2、用具：超净工作台，显微镜，载玻片，天平，三角瓶，
封口膜，橡皮筋，镊子，酒精灯，培养皿，滤纸，剪刀，
医用手术刀，摇床
3、药品：共培养、选择培养培养基，MGL活化培养基，LB
培养基，乙酰丁香酮(AS)
四实验步骤
1、共培养及选择培培养基的配制(第1周已做，没倒皿的组倒皿)
2、无菌苗的制备(张书芹老师做)
3、农杆菌的活化(研究生帮忙做)
·从超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在冰上融化
48hr
·将浑浊的农杆菌液涂布于LB平皿上，28℃暗培养36-48hr
·把培养基表面菌落刮入装有20ml MGL培养基的三角瓶中(按
之间(估计)即可用于侵染(这一步要求同学们课上做的)
4、下胚轴与农杆菌共培养
·把无菌苗切成~7mm茎段(同诱导程序),用镊子夹到经活
化的菌液中进行侵染，摇匀，侵染10分钟
·倒掉菌液，将下胚轴转入装有滤纸的灭菌培养皿中，吹5分钟
使表面稍为干燥
·再将下胚轴分散布于垫有滤纸的共培养培养基中，19-21℃,
暗培养48-60小时结束共培养
5、选择培养(48-60小时后)
·把经过共培养的下胚轴用镊子转入选择培养基中，培养30天
左右继代一次转入相同的选择培养基中。 (请每组指定一个
同学周五上午9:30-11:00来进行选择培养)
农杆菌菌株培养活化 棉花无菌苗的制备
操作流程： \ /
棉花下胚轴与农杆菌共培养
↓48小时
将下胚轴接种于选择培养基中诱导愈伤
(含抗生素和头孢霉素)
愈伤组织的检测
抗性愈伤组织的继代
抗性愈伤组织的分化
再生植株的成苗移栽
五注意事项
1、在切无菌苗时，一定要使用锋利的刀片，尽量做到一刀能切
断，避免挤压茎段。
2、无菌苗培养时间不宜过长(培养七天最好)。
3、从超低温冰箱内取出的甘油管，应尽量减少其在冰箱外的
时间，用完后尽快放回冰箱
4、侵染时下胚轴稍为干燥可以增加农杆菌的吸附
5、共培养后第一次进行选择培养时应尽量使培养的环境保持
干燥，可以减少农杆菌的污染
6、整个过程均为无菌操作环境
六实验结果
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