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实验五植物基因组DNA提取
一、试验目的
掌握植物基因组DNA提取的原理与基本方法。
二、原理
三乙基溴化铵),是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在
高盐溶液中(0.7mol/LNaCI)是可溶的，可通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等
杂质，加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
三、试验材料
植物幼嫩叶片
四、器材与试剂
试剂：裂解液、24:1氯仿/异戊醇、75??醇、异丙醇
五、试验方法与步骤
(一)裂解液的配置
抽提裂解液(PH 8.0): 1L
CTAB(20克);0.1
IECA(1克);2VPK-30(20克)
加0.2?-巯基乙醇后调PH值至8.0。
(二)抽提步骤
1、DNA粗提
(1)取植物幼嫩叶片于研钵中，加入500ul预热到65℃的裂解液，充分迅速研磨。
(2)用剪宽了的200uL枪头将研磨液吸入2mL离心管中。
(3)将离心管置于65℃水浴锅中，水浴30min,每五分钟上下轻轻摇动几次
(4)拿出后等冷却到室温，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1),轻轻上下颠倒混匀至
溶液成一相。
(5)室温12000g离心10分钟。
(6)用剪宽了的200uL枪头取上清至新管，加入2/3体积冰冷的(-20℃)异丙醇，轻轻上
下颠倒混匀，这时会出现絮状的DNA沉淀。
(7)12000 rpm离心5min,弃上清，用1ml75??精洗涤沉淀，自然干燥。
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(8)加入100μl ddH2O,待溶解混匀DNA后放入-20℃保存备用。
(三)DNA纯化
(1)取DNA粗制样品，加入RNase至终浓度10μg/μl,37℃反应30min。
(2)加入等体积氯仿：异戊醇(24:1)抽提，12000 rpm,离心5分钟，取上清。
(3)重复步骤2。
30min,12000 rpm,离心10分钟。
(5)DNA沉淀用70??醇洗2-3次，自然风干，加入30μl TE buffer溶解。
(6)取10μlDNA在1??脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统记录和分析结果，估计样品
DNA分子量。
DNA浓度，判断样品浓度和DNA纯度。
六、DNA制备注意事项
(1)要得到完整的DNA,在粗提的第6步和纯化的第4步时，可挑出絮状DNA沉淀，用
70??醇洗涤1-2次。
(2)步骤3、4、6中要轻轻颠倒试管悬浮沉淀，不可用枪头(尤其是没剪去枪头尖端)吹打
沉淀。
(3)各步中吸上清枪头使用前必须粗吸头(微量移液枪的枪头剪去尖端),避免机械剪切
力对DNA链的损伤。
(4)为了获得高分子量的DNA,操作中必须防止混匀、抽提及沉淀时剧烈机械震荡造成的
DNA的断裂。
(5)如含有RNA,可用100ng/ml的RNase在37℃水解半小时。
(6)为防止酚类物质的氧化，可加0.2???基乙醇
七、试验结果记录与讨论
1、详细记录试验过程，操作中不便记录的，试验后补上。
2、真实地记录试验结果，如有未预期结果，讨论其产生的原因。
3、谈谈如何提取完整的植物基因组DNA。
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