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莲子里黄酮类化合物提取工艺的研究 荷花系。莲子心味甘性寒,入心、肾二经,有清心安神、交通心肾、涩精止血的功效,极具药理研究价值。有研究报道,莲子心含有木犀草苷、金丝桃苷以及芸香苷等黄酮类化合物。黄酮类化合物是酚类物质中的一大类,在自然界中分布广泛,部分分布在植物细胞壁中。目前莲子心中黄酮类化合物的提取方法有溶剂提取法、碱溶酸析法、超声波辅助提取、微波辅助提取法等,但利用酶法辅助提取莲子心中总黄酮未见文献报道。本文利用纤维素酶酶解辅助提取莲子心黄酮,研究其提取工艺,并与常规方法进行比较,制定出低成本,操作简易,提取率高的新工艺。 1 材料和方法 1.1 试剂:芦丁 莲子心(福建建宁产),磨碎,过60目筛;纤维素酶(15 000 U/g),中国医药集团上海化学试剂公司;芦丁对照品(纯度≥98%),拓康生物医药科技有限公司;无水乙醇、Na NO2、Al(NO3)3、Na OH(分析纯),中国医药集团上海化学试剂公司。 1.2 仪器和设备 HH-6恒温水浴锅,常州国华电器有限公司;UV-2000型紫外-可见分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司;SHZ-III型真空泵,上海亚荣生化仪器厂;Fz-02中草药粉碎机,浙江省温岭市百乐粉碎设备厂;台式低速离心机L-530,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司;PL-L型电子分析天平,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;101-1A型鼓风干燥箱,上海阳光实验仪器有限公司;p H仪表,梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。 2 酶法提取条件的研究 2.1 提取溶剂、时间 莲子心除杂,粉碎,过60目筛,制得干莲子心粉。取1 g莲子心粉,按液料比加入适量提取溶剂,调节p H值。加入适量的酶粉,置于恒温水浴锅中,恒温培养一定时间后,沸水浴灭酶5 min。样品过滤,取滤液测定黄酮含量。 2.2 邻苯二羟基化合物的降解 采用Na NO2-Al(NO3)3比色法对松针总黄酮进行定量。具有邻苯二羟基的化合物在Na NO2-A(NO3)3系统中反应,可以在510 nm处产生特征性的吸收,吸光强度和化合物含量呈一定的比例关系。通过测定吸光度值,分析此物质的量。 2.2.1 吸光度测定 准确吸取0.l mg/m L的芦丁对照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 m L,分别置于10 m L容量瓶中,各加30%乙醇至5 m L。先加5%Na NO2溶液0.3 m L,摇匀,放置6 min,再加10%Al(NO3)3溶液0.3 m L,摇匀,放置6 min,加4%Na OH溶液4 m L,各用蒸馏水稀释到10m L,摇匀,放置15 min。以第1管作空白,在510nm波长处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标,芦丁对照品溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线。根据测定结果,用最小二乘法进行线性回归,得标准曲线回归方程:y=0.6174x+0.0011,R2=0.9999,其中y值为吸光度(Abs),x值为芦丁标准溶液质量浓度(mg/m L)。 2.2.2 莲子提取率测定 将酶法处理后的提取液过滤,取1 m L滤液,按照标准曲线绘制的方法进行测定。莲子心内总黄酮含量及提取率的计算如下: 式中,y———吸光度值;x———相当于芦丁标准溶液的质量浓度(mg/m L)。 式中,Y———莲子心中总黄酮的提取率(%);x———相当于芦丁标准溶液的质量浓度(mg/m L);V1———提取溶剂的体积(m L);a———提取液测定时的稀释倍数;m———莲子心粉的质量(g)。 2.3 单因素试验设计 采用酶法辅助提取莲子心中黄酮类物质,通过单因素试验方法考虑酶添加量、反应时间、温度、p H值、浸提溶剂以及液料比等因素对莲子心黄酮提取率的影响。单因素试验设计如下: 溶剂体积分数:0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%; 液料比:10∶1,20∶1,30∶1,40∶1,50∶1,60∶1; 酶解温度:30、40、50、60、70、80℃; 酶解时间:0.5、1、1.5、2、2.5、3h; 酶添加量:0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%; p H值:4、4.5、5、5.5、6。 2.4 提取率的响应面分析 在单因素试验的基础上,根据Box-Benhnken(BBD)试验设计原理对总黄酮的提取率进行响应面分析。观察各因素对提取率的综合影响,拟建立提取率和各因素间的定量关系。试验辅助软件为Design Expert(version 8.0.3)。 2.5 与其他提取方法的比较 乙醇提取法:取1 g莲子心粉,按1∶19的液料比加入50%乙醇溶剂,于50℃水浴条件下浸提2h,测其黄酮含量。 3 试验结果与分析 3.1 单因素试验的结果和分析 3.1.1 乙醇体积分数对莲子心总黄酮提取率的影响 分别使用0%~70%的乙醇体