正交设计优化姜酚提取工艺及高效液相色谱-二极管阵列检测法的含量测定.docxVIP

正交设计优化姜酚提取工艺及高效液相色谱-二极管阵列检测法的含量测定 根据现代药理学研究，姜具有清热、镇痛、抗炎、抗心力衰竭、抗菌、排泄、促进胆混合、抗血小板聚集等药理活性。姜中的化学成分主要包括挥发油、二苯庚烷类和姜辣素类化合物,其中二苯庚烷类和姜辣素化合物为不挥发性成分。姜酚是姜中辣味成分的主要组分之一,具有强心、降压、降血脂、降血糖、抗血小板、抗氧化、抗肿瘤、抗炎止痛等广泛的药理作用。中国药典2005年版只规定了挥发油测定作为干姜的含量测定方法,无法体现干姜中多种化学成分的组成情况,且仅以挥发油的含量评价干姜质量也具有非常明显的片面性,忽视了不挥发性成分的作用,难以有效评价和控制干姜的质量。本研究以6-姜酚为指标成分,通过正交设计优化提取干姜中不挥发性成分,为相关的质量控制研究提供方法和依据。 1 中药粉碎机和培养基 Agilent 1100 HPLC-DAD高效液相色谱仪;METTLER AE240电子天平;DFT-200中药粉碎机;SK2200H超声仪。6-姜酚对照品购自上海同田生物技术有限公司,经HPLC面积归一化法检查,纯度均大于98.5%。干姜购自上海养和堂中药饮片有限公司,经鉴定为姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.根茎干燥的加工品。甲醇为色谱纯,余均为分析纯,水为去离子水。 2 方法和结果 2.16 -姜酚的含量测定 2.1.1 流动相、检测波长 色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×150.0 mm,5 μm);流动相:甲醇-水(60∶40);检测波长:282 nm;流速:1.0 ml/min;柱温:25 ℃;进样量:10 μl。 2.1.2 对照品储备液的制备 精密称取6-姜酚对照品15.05 mg,置10 ml量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每1 ml中含6-姜酚对照品1.505 mg),作为对照品储备液。精密量取适量储备液分别加甲醇稀释,可得浓度为1.505、7.525、15.050、150.500、301.000 μg/ml的系列对照品溶液,置于4 ℃冰箱保存。 2.1.3 超声活化法 取干姜粉末约0.16 g(过40目筛,40℃干燥至恒重),精密称定,置10 ml容量瓶中,加甲醇9 ml,浸泡40 min,超声处理45 min,放冷至室温,加甲醇至刻度,摇匀,0.45 μm滤膜滤过,弃去初滤液,取续滤液,即得。 2.1.4 系统适应性研究 以对照品溶液进样,根据色谱参数计算系统适应性。6-姜酚色谱峰的理论塔板数为6610,分离度为10.636,拖尾因子为0.981。 2.1.5 标准曲线的绘制 将不同浓度的系列对照品溶液依次连续进样测定(n=3),以对照品溶液的浓度为横坐标(X),峰面积值为纵坐标(Y)绘制标准曲线,计算回归方程Y=4.067 X-1.927(γ=0.9999),结果见图1。 2.1.6 方法的精密度 分别取低、中、高3种浓度的对照品溶液,在1天之内连续进样3次,以及连续3天分别进样,检测峰面积,进行日内和日间精密度(RSD)考察,其峰面积的RSD分别为1.08%和1.30%,0.71%和1.28%,0.59%和1.04%。 2.1.7 样品溶液的制备 精密称定干姜粉末0.16 g,按照“2.1.3”项下方法制备样品溶液。分别在0、0.5、1、2、4、8、12、24 h测定6-姜酚的含量,进行稳定性考察,其峰面积的RSD为0.43%。 2.1.8 方法的重复性 精密称定干姜粉末6份各0.16 g,分别按照“2.1.3”项下方法制备样品溶液,测定6-姜酚的含量,进行重复性考察,其峰面积的RSD为1.32%。 2.1.9 -姜酚最低检测条件 将1.505 μg/ml 6-姜酚对照品溶液的峰高与空白溶剂进样的噪声进行比较,以信噪比3∶1计算6-姜酚能被检测出的最低浓度为0.2508 μg/ml。 2.1.1 -姜酚最低检测条件的确定 将1.505 μg/ml 6-姜酚对照品溶液的峰高与空白溶剂进样的噪音进行比较,以信噪比10∶1计算6-姜酚能被检测出的最低浓度为0.8361 μg/ml。 2.1.1 加样回收率试验 精密称定6-姜酚含量分别为0.62%的干姜粉末9份,各0.16 g,分别精密加入6-姜酚对照品储备液0.54、0.68、0.82 ml,按“2.1.3”项下方法制备样品溶液,测定6-姜酚的含量,考察加样回收率。结果分别为98.47%、100.78%、101.11%;RSD分别为0.89%、1.05%、1.89%。6-姜酚对照品和干姜HPLC-DAD含量测定色谱图见图2。 2.26 -姜酚提取优化 2.2.1 因素试验 以6-姜酚的含量(Y)为评价指标,选择固液比例(A)、浸泡时间(B)和超声时间(C)3个因素进