解毒通络利湿方及拆方对类风湿性关节炎的抗炎镇痛及调节免疫作用比较.docxVIP

解毒通络利湿方及拆方对类风湿性关节炎的抗炎镇痛及调节免疫作用比较 类风湿性关节炎（ra）是一种难治性免疫疾病。中医临床上常出现寒热夹杂、虚实消息。本课题组运用解毒通络利湿法治疗活动期RA取得了较好的疗效,现为了进一步验证其抗炎镇痛作用,并探讨解毒、通络、利湿法组合的原理,开展解毒通络利湿方及其拆方的药效、药理实验比较研究。 1 材料表面 1.1 动物 Wistar大鼠,体重(180±20) g;昆明种小白鼠,体重(20±2) g,均由浙江中医药大学实验动物中心提供。 1.2 elisa试验 卡介苗(上海生物制品研究所,批号200504012),石蜡油(江苏鸿声化工厂,批,羊毛脂(上海华亭羊毛脂厂,批号030201)。Freund’s完全佐剂和卵白蛋白-Freund’s完全佐剂根据《药理学实验方法学》配制。白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 和前列腺素E2(PGE2)定量ELISA试剂盒(美国Biosurce公司)。550型酶标仪(Biorad公司)。 1.3 植物溶解方 甲氨喋呤片(MTX,2.5 mg/片,上海信谊制药公司,批号050136)。实验所用中药材均同一批购于浙江中医药大学第二附属医院,解毒通络利湿方:忍冬藤、赤芍、桂枝、全蝎、薏苡仁等;解毒方:忍冬藤、赤芍;通络方:桂枝、全蝎;利湿方:薏苡仁;解毒通络方:忍冬藤、赤芍、桂枝、全蝎;解毒利湿方:忍冬藤、赤芍、薏苡仁;通络利湿基本方:桂枝、全蝎、薏苡仁等。中药材先用蒸馏水浸泡0.5 h,水煎0.5 h,共煎2次,将2次的药物滤液混合,均浓缩成生药含量1.0 g·mL-1(即100%药液),放置4 ℃冰箱保存备用。 2 方法 2.1 抗炎和调整免疫 2.1.1 关节水肿率测定 选Wistar大鼠右足后跖皮内注射Freund’s完全佐剂0.1 mL致炎。致炎第1天即开始给药,连续给药30 d。并于第14天起用游标卡尺测右足后跖厚度,每隔3 d记录1次,求出关节肿胀率。肿胀率(%)=(给药后值-给药前值)/给药前值×100%。 2.1.2 mtx混悬液给药剂量 100只Wistar大鼠,雌雄各半,随机分为10组:正常组(灌胃生理盐水)、模型组(灌胃生理盐水)、解毒通络利湿组(灌胃解毒通络利湿方,7.01 mg·kg-1)、解毒通络组(灌胃解毒通络方,5.35 mg·kg-1)、解毒利湿组(灌胃解毒利湿方,5.53 mg·kg-1)、通络利湿组(灌胃通络利湿方,3.14 mg·kg-1)、解毒组(灌胃解毒方,3.87 mg·kg-1)、通络组(灌胃通络方,1.47 mg·kg-1)、利湿组(灌胃利湿方,1.66 mg·kg-1)和西药对照组(灌胃MTX混悬液,0.92 mg·kg-1)。给药剂量均参照临床用量,根据人与大鼠间的折算系数(0.11∶0.71)换算。除正常组用等容积生理盐水替代免疫致炎物质之外,其余各组均在注射Freund’s完全佐剂致炎后给药,药液均用蒸馏水稀释成2 mL后灌胃。 2.1.3 il-1,tnf-,pge2含量测定 连续给药30 d,于末次用药24 h后,摘眼球取血,离心后吸取血清,冷冻保存。测定前置室温或冷水中复融混匀,4 ℃,3 000 r·min-1,离心5 min,取上清测定。按照试剂盒说明书,用双抗体夹心ABC-ELISA 法,测IL-1β,TNF-α和PGE2含量。取脾脏和胸腺称量,计算脏器指数,脏器指数(%)=(脏器平均重/平均体重)×100%。 2.2 抗抑郁药 2.2.1 扭体抑制率测定 昆明小鼠,雌雄各半,体重(20±2) g,分别灌胃给药1次/d,连续3 d。末次给药后1 h后腹腔注射0.6%冰醋酸0.01 mg·kg-1,5 min后开始记录20 min内扭体次数。计算扭体抑制率。抑制率(%)=(模型组扭体次数-给药组扭体次数)/模型组扭体数×100%。 2.2.2 灌胃给予小鼠的痛阈指标 昆明小鼠,雌性,体重(20±2) g,预先以(55±0.5) ℃ 热板进行筛选,在10~30 s内出现舔足反应的为合格小鼠,以疼痛反应潜伏期为痛阈指标,给药前测2次,以其均值为基础痛阈。分别灌胃给药1次/d,连续3 d。末次给药1 h后用热板测痛仪观察小鼠对疼痛的反应。记录痛阈变化,并计算痛阈提高百分率,痛阈提高率(%)=(给药后痛阈-给药前痛阈)/给药前痛阈×100%。若60 s内未出现舔足反应,痛阈计为60 s。 2.2.3 mtx混悬液组 将小鼠随机分为9组,每组10只。模型组(生理盐水)、解毒通络利湿组(解毒通络利湿方,9.87 mg·kg-1)、解毒通络组(解毒通络方,7.54 mg·kg-1)、解毒利湿组(解毒利湿方,7.79 mg·kg-1)、通络利湿组(通络利湿方,4.42