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超滤法分离纯化低聚肽的分子排阻色谱检测 食物过敏是一个全球健康问题。在过去的几十年里，食物过敏的普及成为食品工业的主要挑战。据统计, 2%的成人和5%~8%的儿童存在不同程度的食品过敏, 严重威胁着人们的身体健康, 因此迫切需要开发低过敏甚至抗过敏的药物或者食品。食源性低聚肽是以动植物食物蛋白为原料, 经过生物酶水解、分离、精制得到的小分子肽的混合物, 包括存在于动物、植物、微生物体内的天然生物活性肽和蛋白质降解后产生的外源性肽。低聚肽整体分子量较小, 以分子量在1000 u以下的小肽为主, 吸收迅速, 具有促消化吸收、降胆固醇、降血压、增强免疫、抗肥胖、 降血糖、抗氧化、缓解疲劳等一系列的营养价值与生理功能, 但是关于其抗过敏活性的研究国内鲜有报道。本文采用透明质酸酶抑制法检测食源性低聚肽包括大豆肽、小麦肽、玉米肽、乌鸡肽、胶原肽等的抗过敏活性, 为进一步的深入研究及抗过敏食品开发奠定基础。 1 试剂和仪器 大豆肽、乌鸡肽、小麦肽、胶原肽、玉米肽:北京中食海氏公司;儿茶素:江西绿康公司;透明质酸酶、透明质酸钠:SIGMA公司;对- 二甲氨基苯甲醛:上海试剂二厂;乙酰丙酮、乙醇、醋酸、醋酸钠、氢氧化钠等化学试剂和药品均为分析纯。 UNICO UV-2100型分光光度计;GSY-II恒温水浴锅;Vivaflow 50超滤器:赛多利斯公司; LC-20AD型高效液相色谱仪:日本SHIMAD-ZU公司;色谱柱:TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8mm, 日本TOSOH公司。 2 测试方法 2.1 米肽的液相分离和表征 分别称取5 g大豆肽、乌鸡肽、小麦肽、玉米肽溶解于50 m L蒸馏水中, Vivaflow超滤器超滤去除大分子组分, 冷冻干燥保存, 并对其进行液相分子量分布检测。 2.2 检测波长和温度 色谱柱:TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm; PDA检测器;流动相:v (乙腈) :v (水) :v (三氟乙酸=45:55:0.1 (体积比) ;检测波长:UV220 nm;流速:0.5 m L/min;柱温:30 ℃;进样体积:10 μL。 相对分子质量校正曲线所用标准品:细胞色素C (MW12500) , 杆菌酶 (MW1450) , 乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸 (MW451) , 乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸 (MW189) 。 2.3 低聚肽与儿茶素的配制 2.5 mmol/L Ca Cl20.1 m L加入至0.5 m L透明质酸酶 (500 Unit/m L) 液中, 37 ℃培养20 min;配制不同浓度的低聚肽和儿茶素溶液, 各加入0.5 m L, 37 ℃保温40 min;加入透明质酸钠 (0.4 mg/m L) 37 ℃保温40 min, 加入乙酰丙酮溶液 (3.5 m L乙酰丙酮溶于50 m L 1.0 mol/L碳酸钠溶液, 新鲜配制使用) 1 m L, 沸水水浴15 min, 立即冰水冷却5 min, 加入P-DAB试剂3 m L, 放置30 min, 显色, 在53 nm下测定OD值。 2.4 吸光度值的测定 式中:A为 (透明质酸酶+样品+透明质酸钠) 溶液的吸光度值; B为 (醋酸缓冲液+样品+醋酸缓冲液) 溶液的吸光度值; C为 (透明质酸酶+蒸馏水+透明质酸钠) 溶液的吸光度值; D为 (醋酸缓冲液+蒸馏水+醋酸缓冲液) 溶液的吸光度值。 3 结果与分析 3.1 透明质酸酶活性的体外检测 将超滤纯化的食源性低聚肽进行液相检测, 低聚肽经过分子排阻色谱之后, 样品按照分子质量的差别得以分离。使用分子排阻色谱测定分子质量分布专用的GPC数据分析软件, 分析谱图检测样品中不同分子量的分布范围。从表1可以看出, 5种低聚肽分子量小于1000 u的都大于或者接近90%, 其中乌鸡肽含量最高可达96.87%。分子量1万以上的蛋白含量很低, 除大豆肽以外含量都为零。Maingonnat报道, 大分子蛋白成分如牛血清白蛋白或球蛋白、人血清白蛋白、转铁蛋白或血红蛋白均能提高透明质酸酶的活性。5种食源性低聚肽分子量90%都位于1000 u以下, 具有调节免疫、增强抵抗力的作用, 可以对透明质酸酶的活性产生一定的抑制作用。2008年Kyungjong Kim从病人的血清中分离出了具有抗过敏活性的肽段LSYLLWRSRLP、LVAHV GAGGVL、RVSSCRG RNHIV、ETIGARWVRIE、TDGVTYTNDCL、 RVVRYD ADFWI、GFWC RRSGLVGV, 可以显著地抑制抗原刺激的肥大细胞的组胺释放, 同时也可以降低大鼠嗜碱性粒细胞β-己糖胺酶的释放, 减轻细胞内钙离子的升高。这表明蛋白水解后形成的特定肽段具有较强的抗过敏活性。本文以透明质酸酶抑制