单克隆抗体制备流程.docVIP

单抗制备流程 1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。 制备单克隆抗体涉及动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要通过几个月的一系列实验环节，下面按照制备单克隆抗体的流程次序，逐个介绍其实验办法。 一、细胞融合前准备 (一)　免疫方案 选择适宜的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。普通要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。 1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得较好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案: 　　　　　　初次免疫　　　　　　1×10７／0.5ml ip (腹腔内注射) 　　　　　　　　↓　2～3周后 　　　　　　第二次免疫　　　　　1×10７／0.5ml ip 　　　　　　　　↓　3周后 　　加强免疫(融合前三天)　1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射) 　　　　　　　　↓ 　　　　　　取脾融合 2.可溶性抗原免疫原性弱，普通要加佐剂，惯用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。规定抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易立刻扩散呈小滴状表明已达成油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充足混匀。 　　初次免疫　 Ag　1～50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射 　　　　│　　(普通0.8～1ml　0.2ml／点) 　　　　↓3周后 　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip 　　　　│　　　　　　　(ip剂量不适宜超出0.5ml) 　　　　↓3周后 　　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip 　　　　│ (5～7天后采血测其效价，检测免疫效果) 　　　　↓2～3周后 　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv 　　　　↓3天后 　　　取脾融合 现在，用于可溶性抗原(特别是某些弱抗原)的免疫方案也不停有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，首先增强了抗原的免疫原性，另首先可减少抗原的使用量。②变化抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平，增进免疫细胞对抗原反映性。 (二)　喂养细胞 在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加喂养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入喂养细胞是十分必要的。惯用的喂养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为惯用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为喂养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长久保存，随用随复苏。 　小鼠腹腔巨噬细胞的制备 　小鼠采用与免疫小鼠相似的品系，惯用BaLb／c小鼠6～10周龄 　　↓ 　拉颈处死　浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟 　　↓ 　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 　　↓ 　用无菌注射器注入6～8ml培养液 　　↓ 　重复冲洗，吸出冲洗液 　　↓ 　放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟 　　↓ 　用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调节细胞数1×10５／ml 　　↓ 　加入96孔板，100μl／孔 　　↓ 　放入37℃　CO2孵箱培养 普通喂养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为喂养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。 (三)　骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量　McAb。 惯用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。 骨髓瘤细胞的培养适合于普通的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度普通在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，普通扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。 普通在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以避免细胞的突变。 确保骨髓瘤细胞处在对数生长久，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的核心。 (四)　免疫脾细胞 免疫脾细胞指的是处在免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。普通取最后一次加强免疫3天后来的