单克隆抗体手册.docVIP

单克隆抗体技术 第一节 单克隆抗体的研制 一、单克隆抗体的概念 抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的办法产生的，因而抗血清普通含有针对其它无关抗原的抗体和血清中其它蛋白质成分。普通的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，因此常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体构成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差别很大，使它在免疫化学实验等使用中带来许多麻烦。因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能确保无限量供应的抗体是免疫化学家长久梦寐以求的目的。随着杂交瘤技术的诞生，这一目的得以实现。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞含有双亲细胞的特性，既像骨髓瘤细胞同样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞地单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。 与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，并且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，增进了众多学科的发展。 Kohler和Milstein两人由此杰出奉献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。 二、杂交瘤技术 （一）、杂交瘤技术的诞生 淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然成果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体构造与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了技术储藏。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌含有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的着名论文。他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和互相融合的脾细胞是HGPRT+，但不能持续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和互相融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的持续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。实验的成果完全像起始设计的那样，最后得到了诸多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。 这一技术建立后很快，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改善。最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更加好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。随即建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，因此由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的局限性。再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和办法是同样的。 （二）、基本程序和办法 杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。本节中介绍的办法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。 在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须含有下列重要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。其需要的重要器械涉及：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，