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微量提取西藏黄籽油菜干种子dna的方法比较 sdr（简单受体）是基于pcr（polimate）假设的分子遗传标记，也称为微卫星dna（微卫生剂）标记。这是一种由两个和五个反射单胞组成的重复序列，由重复单元组成，每个反射单胞。现在，这些证明存在于大多数真核生物群。20世纪90年代以来已经被遗传家广泛用于大田作物, 品种鉴定与分类等种质资源研究的各个领域。 油菜为十字花科芸薹属, 是西藏的主要经济作物。西藏油菜资源, 有着很好的优势, 不少地方分布有非常珍贵的油菜种质资源, 尤其是黄籽油菜品种。迄今为止, 关于西藏黄籽油菜的研究, 国内外报道的不多, 特别是分子水平的研究更少。本文以西藏黄籽油菜种子为研究材料, 采用十二烷基磺酸钠 (SDS) 和十六烷基三乙基溴化铵 (CTAB) 法分别提取了油菜干种子的DNA, 并对提取的DNA的质量进行比较分析, 以探讨哪种方法更适于制备SSR分子标记的模板DNA。 1 材料和方法 1.1 材料表面 所采用的8个样品来源于山南洛扎县等西藏部分地区, 并在林芝进行隔离自繁。 1.2 提取dna的方法 1.2.1 半干法提取沉淀 取自繁黄籽油菜干种子放入冷冻过的研钵中, 先粗磨, 加750ul预热好的2% CTAB buffer (1.4M NaCl, 100mM Tris-HCI PH 8.0, 20mM EDTA PH8.0 , 2%CTAB ) , 迅速磨成浆湖状;将其移入1.5ml离心管中, 在65℃水欲锅中温育1小时, 期间每隔10分钟剧烈震荡2～3分钟;温育完成后加入等体积的氯仿∕异戊醇, 颠倒离心管混匀, 室温下12000rpm/ min, 离心10min;取上清液转入另一1.5ml离心管中;加上清液1∕10体积的3M NaAC和等体积冰冻异丙醇, 10000 rpm离心2min, 收集沉淀;用76%乙醇 (含10mM NH4AC) 浸泡沉淀2分种后, 弃乙醇, 再次用乙醇清洗一遍, 在室温下风干;风干后加200 ulTE (10mM Tris pH7.5 , 1mM EDTA pH 8.0, ) 溶解DNA, 再加入10 ul 10mg/mlRNase在37℃温育40分钟, 后-20℃保存备用。 1.2.2 u3000rpm-naac-等体积分散剂的制备 取自繁黄籽油菜干种子放入冷冻过的研钵中, 先粗磨, 加750ul预热好的提取缓冲液 (100mM Tris-HCI , 50mM EDTA , 0.5M NaCl, 2%SDS, 用NaOH 调PH 值为8.0 ) 迅速磨成浆湖状;装入1.5ml 离心管, 在65℃水欲锅中温育1小时, 期间每隔10分钟剧烈震荡2～3分钟;温育完成后加入等体积的氯仿∕异戊醇, 颠倒离心管混匀, 室温下12000rpm/ min, 离心10min; 取上清液转入另一1 .5ml离心管中;加上清液1∕10体积的3M NaAC和等体积冰冻异丙醇, 10000 rpm离心2min, 收集沉淀;用76%乙醇 (含10mM NH4AC) 清洗2次, 弃乙醇, 在室温下风干;风干后加200ulTE (10mM Tris pH7.5 , 1mM EDTA pH 8.0, ) 溶解DNA, 在37℃温育30 min后加入10 ul 10mg/mlRNase, 消化RNA30min, 后-20℃保存备用。 1.3 紫外分光光度法检测dna质量 1.3.1 取10μl的DNA 进行1%的琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色, 紫外分析仪下观察照相, 检测DNA 质量。 1.3.2 用紫外分光光度计分别测定稀释3500倍的DNA 样品在波长260 、280 nm 的光密度值D260 、D280 。利用D260计算DNA 样品的浓度、D260 / D280 评价DNA 样品的纯度。 1.3.3 将SDS法、CTAB法所提取的总DNA稀释4倍后进行SSR标记。 2 结果与分析 2.1 dna的提取 采用8 个品种 (1～8号样品) , 用SDS 和CTAB 法分别提取其DNA , 利用UV1100紫外分光光度计测定所得DNA 的D260 、D280 值, 并计算其D260 / D280 值。由表1 可知, 用CTAB 法提取DNA 的产率比采用SDS 法 (除个别样品外) 要高许多;并且采用CTAB 法提取DNA 的D260 / D280 值相对更接近1.8, 其最小比值为1.29, 最大比值为2.71;而SDS法提取样品DNA的D260 / D280 值较低, 62.5%izhixiang在1.03～1.07 之间, 说明样品DNA中含有蛋白质。 2.2 dna的比较 图1是采用CTAB法和SDS法提取的样品DNA 在1%的琼脂糖凝胶上的电泳图谱。从图1可以看出, 各个样品均有