基于rapd标记的卷柏属药用植物遗传多样性研究.docxVIP

基于rapd标记的卷柏属药用植物遗传多样性研究 以往的生药鉴定方法基于生物遗传表现型，不仅受遗传因素的影响，而且与材料的生长发育、环境条件、人类活动（如引进、加工、加工和生产）密切相关。具有主观性强、重复性和稳定性低等缺点。在确定药物的纯度、雄性和近缘剂、稀有药物、道教药物、野生和栽培材料以及单一处方制剂的成分时，非常有限。分子生药学(Molecular Pharmacognosy)的发展为生药的正本清源及质量监测提供了新的手段和方法。其中RAPD标记因其操作简便、DNA用量少、PCR引物无种属限制、高速高效、费用低等特点,在中药鉴定研究种下水平的DNA指纹图谱构建、真伪鉴定、亲缘关系、遗传多样性及药材道地性研究等诸方面都得到应用(黄璐琦,2000;张太平等,2000)。 卷柏属(SelaginellaBeauv.)是一年或多年生草本蕨类植物,全世界700多种,我国约50种,产于全国各地,其中20多种为药用植物,具有活血化淤、清热解毒、消炎抗癌等功效,被用于治疗癌症、肺炎、风寒咳嗽等症。卷柏属植物由于植株矮小,分类性状不明显,是分类较为困难的一个属,在制药生产过程中容易混淆。但由于不同种所含化学成分不同,疗效也有所不同(何薇等,2000),因此正确鉴定非常重要。虽然在微形态和HPCE指纹图谱鉴定和分类方面已有工作开展(肖新月等,2001;常崇艳等,1999;王钢力等,2002),但在分子水平上的研究还未见报道。 本文利用RAPD标记,对广东省卷柏属10种植物进行分子标记鉴定和分类,为卷柏属药材DNA指纹图谱的构建奠定基础,并初步探讨其种间亲缘关系和遗传多样性。 1 材料和方法 1.1 营养器官标本不鉴定到种 在广东省采集10种卷柏植物,每种采集12~18不等个体,其中1种由于只采集到营养器官标本,未能鉴定到种和命名(表1)。新鲜叶片在野外用硅胶干燥,保存至DNA提取,凭证标本保存于中科院华南植物园标本馆(IBSC)。 1.2 总dna提取 叶片用液氮研磨,改良CTAB法提取(余艳等,2003)。 1.3 pcr检测taq酶 从100个生工S-系列RAPD引物中筛选出10条位点清晰、重复性良好的引物对所有个体进行PCR扩增(表2)。20微升PCR反应组分为:10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,2.5 mmol/L MgCl2,0.1 mmol/L dNTPs,200 nmol/L引物,1.5单位Taq酶,20 ng总DNA;对照用双蒸水代替总DNA。在PTC-200(MJ research)热循环仪上扩增程序为:94 ℃,5 min,1个循环;94 ℃,1 min,35 ℃,1 min, 72 ℃, 2 min, 45个循环; 最后72 ℃延伸7 min。扩增产物于1.8%琼脂糖凝胶、0.5×TBE缓冲液3~4 V/cm场强下电泳3 h,经EB染色30 min,水洗10 min,紫外灯下观察,照相(LabWorks Software Version 3.0;UVP,Upland,CA 91786,USA)。 1.4 多态位检出率 以100 bp的Marker作为分子量标准,在某一个位点上,明确无误的位点记为“1”并估测分子量大小,模糊位点和无位点记为“0”,检出每种的多态位点(包括种特征单态位点、种特征多态位点和多态位点),并计算种水平和属水平多态位点数和多态位点百分率;在属水平所有位点1/0数据矩阵基础上,用Popgene分析软件计算出各种间的Nei氏(1972)遗传距离和遗传相似性矩阵(Yeh等,1999),在遗传距离的基础上,采用非加权配对算术平均法(UPGMA),绘出各种亲缘关系聚类图。 2 引物interpersonal的遗传距离分析 10个引物在150个个体共扩增出279个位点,分子量大小在1 580~150 bp之间,其中51(18.28%)个位点为种特征单态位点,具有物种特异性,有鉴定物种的作用;还有7个种特征多态位点,具有一定的鉴定物种作用(表1、2)。 各引物扩增的位点数从24~34不等,平均27.9个;各引物在种内扩增的位点数从2(S106-S2)到19(S155-S3),差别较大,从另一个方面说明引物在种间具有较大的选择差异性;其中S163,S122,S124,S141,S106,S157和S190在种间具有很好的区分性(图1,表2)。种内位点数从65(S10)~96(S5),平均81.9,保证了计算结果的可靠性。 Nei氏遗传距离(D)在种间变化从0.231 51(S 9 vs.S.involvens)到0.640 6(S.flagelliferavs.S.moellendorffii)(表3),显示种间具有较大的物种差异。10个物种在距离0.45处分为两支(图2)。在属