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登革病毒非结构蛋白ns3的研究进展 病毒：它们属于黄毒科黄色病毒。这是一个有膜的单带负旋病毒。根据其抗原性，可分为四种类型。同一类型中的不同株也有抗原性差异，其中两种是最常见的。各型病毒间抗原性有交叉，与乙脑病毒和西尼罗病毒也有部分抗原相同。登革病毒经蚊（主要是埃及伊蚊）传播，可引起人类登革热（DF）、登革出血热（DHF）和登革休克综合征（DSS）。近年来登革热及登革出血热在亚洲、太平洋群岛及中、南美洲许多国家都已造成严重的威胁。我国于1978年在广东佛山首次发现本病，以后在海南岛及广西等地均有发现。据报道，全球约25亿人口受到登革病毒感染的威胁。 登革病毒基因组长约11kb，病毒RNA具感染性，其基因组RNA的5′端有Ⅰ型帽子结构，3′端无poly(A)结构。病毒RNA只含1个长的开放读码框（ORF），约96%的核苷酸在此框架内，ORF两侧为5′端和3′端非编码区（UTR）。整个基因的编码顺序为：5′-Ⅰ型帽子结构-UTR-AUG-C蛋白（衣壳蛋白）基因-M蛋白（膜蛋白）基因-E蛋白（包膜蛋白）基因-NS1基因-NS2A基因-NS2B基因-NS3基因-NS4A基因-NS4B基因-NS5基因-UTR。在病毒编码的蛋白酶（NS3）及宿主细胞酶的作用下，该多聚蛋白形成3种结构蛋白和7种非结构蛋白，这些蛋白随后参与发生在感染细胞胞浆中病毒的复制（图1）。 登革病毒非结构蛋白NS3(non-structural）的编码基因在黄病毒中具有高度的保守性，基因全长1 854 bp，编码618个氨基酸残基，是病毒编码的第二大蛋白。近年来的研究表明，NS3是一种多功能蛋白，N端具有Ser蛋白酶活性，C端具有RNA解旋酶及NTPase、5′RNA三磷酸酶等活性，参与病毒前体的加工和病毒RNA的复制及基因组RNA的5′端加帽。该蛋白具有很好的免疫原性，并存在特异性CD4+和CD8+识别表位，可诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。 1 gly残基对ns3蛋白酶表达的激活作用 黄病毒科病毒多聚蛋白翻译后的加工，需要宿主细胞来源的蛋白酶和病毒编码的蛋白酶共同完成。与其他黄病毒科病毒一样，登革病毒的NS3具有胰凝乳蛋白酶样的活性中心（His51,Asp75,Ser135）。NS2B作为其辅助因子，与NS3形成异源二聚体复合物发挥蛋白酶活性。NS2B-NS3复合体切割的多聚蛋白前体位点为NS2A/NS2B、NS2B/NS3、NS3/NS4A、NS4B/NS5连接位点及C蛋白、NS2A、NS3、NS4A蛋白分子内的切割位点，这些切割识别位点在P2和P1位点具有相同的序列，即2个碱性氨基酸（KR,RR,RK，偶尔为QR），在P1′位为Gly、Ala或Ser。该蛋白酶对NS2A/NS2B、NS2B/NS3、NS3/NS4A为顺式切割，对NS3/NS4A、NS4B/NS5为反式切割。宿主细胞蛋白酶、信号肽酶（signalase）和弗林蛋白酶（furin）作用余下的切割位点（图2）。 NS3蛋白酶结构域突变分析表明，N端167个氨基酸残基为保持蛋白酶活性的最小结构域。通过缺失重组试验及相似性分析，NS2B蛋白内一段40个氨基酸残基（Lys54～Glu93）长的核心保守亲水序列即可激活NS3蛋白酶活性；这段序列无论是直接联在NS3编码区的上游还是通过与柔性连接子相连，构建的重组蛋白都是有活性的。该区域N端侧有2个疏水区，C端侧有1个疏水区，其作用可能为协助NS2B全长蛋白定位于感染细胞内质网膜（ER）并有效激活NS3蛋白酶活性。通过对登革病毒NS3蛋白酶的同源建模，推测NS2B核心亲水区的12个氨基酸残基（70GSSPILSITISE81）可能直接与NS3结合，其核心区域与HCV NS3蛋白酶辅助因子NS4A有同源性。 Wu等将NS2B亲水区重组表达于GST的C端，其表达的可溶性重组蛋白仍能作用于NS2B-NS3结合区激活NS3蛋白酶功能。他们对NS2B蛋白40个氨基酸残基长的核心亲水区的缺失突变分析表明，其C端4个连续的谷氨酸可以缺失，每个氨基酸的缺失都将导致其活性的进一步丧失，但N端边界则是绝对保守的，不能缺失。 对天然底物或P1、P2位点为碱性氨基酸（Arg,Lys）的发光肽底物的反式酶切作用，NS3的蛋白酶活性依赖于NS2B。NS2B激活的蛋白酶活性比NS3单独的酶切活性提高了3 300～7 600倍，而对于发光底物N-α-苯甲酰-L-Arg-对硝基苯胺（BAPNA），单独存在的NS3活性更高，这可能缘于2种蛋白酶在底物结合区的构象差别，短肽（只含P1位点）能够进入NS3蛋白酶的狭小的底物结合“裂缝”而无需NS2B的辅助。NS2B的结合造成了NS3的构象变化，使得底物侧链能有效进入其结合“口袋”，底物得以切割。DEN2蛋白酶复合物与发光肽底物的相互作用