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我国新城疫病毒ndv的分子遗传研究 新城病（nd）是一种由同一只鸟类引起的急性和烈性感染疾病，主要属于鸡和鸡。发病率和死亡率很高。这是中国养鸡业最严重的疾病之一。国际兽医卫生组织(OIE)将其定为A类动物疫病,中国将其定为一类动物传染病。NDV虽然只有一个血清型,但毒株众多,毒力差别较大,给ND的防制带来极大困难。 NDV是一种具有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒,由15186个核苷酸组成。基因组包含6个基因,分别编码3′ NP_P_M_F_HN_L 5′六个主要多肽(即NP核蛋白、P磷蛋白、M基质蛋白、F融合蛋白、HN血凝素-神经氨酸酶和L聚合酶)。NDV的囊膜由F和HN两个糖蛋白组成,F糖蛋白能够融合宿主细胞膜,使病毒侵入宿主细胞内;HN糖蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性,在病毒侵染过程中识别细胞受体、介导病毒吸附细胞膜。这两种基因产物决定着NDV的毒力强弱。因此,对F和HN进行分子遗传变异研究,对了解和把握NDV的变异规律具有重要意义。 然而,国内外尚未有F和HN基因遗传变异相关性的研究报告。本文对近年来在国内分离、鉴定的NDV,分别进行了F和HN基因克隆测序,并对二者的遗传变异做了相关比较。 1 材料和方法 1.1 材料表面 1.1.1 h9和h77 1999～2005年间山东、江苏等NDV分离株,采用HA和HI交叉抑制试验,排除H9和H5亚型禽流感、减蛋综合症(EDS_76)等具有HA特性的病毒。利用CEF对分离株进行蚀斑纯化3代后接种10日龄SPF鸡胚,进行病毒增殖,利用差速离心法进行浓缩病毒。 1.1.2 试剂和增强剂 TRIzol为Gibco BRL产品;AMV逆转录酶、Rnasin、pGEM_T Easy Vector 购自Promega公司;DNA回收试剂盒、dNTPs购自TaKaRa(大连)公司。PCR Master Mix增强剂购自北京朋远公司。DH5α由山东农科院家禽所禽病重点实验室保存;SPF种蛋由山东家禽所SPF鸡场提供。 1.1.3 hn基因pcr扩增 参照GenBank中NDV的F和HN序列,利用Primer设计两对引物,T1和T2用于扩增F基因(1700bp),HN1和HN2用于扩增HN基因(1801bp)。引物由上海Sangon合成,序列为:T1:5′_ATGGGCTCCAAACCTTCTAC_3′,T2:5′_TTGTAGTGG CTCTCATC_3′;HN1:5′_TCCGTTCTACCACATCACCA_3′,HN2:5′_CGTCTTCCCAACCATCCTAT_3′。考虑到NDV不同编码基因均有共同的起始序列,设计通用RT引物:5′_ACGGGTAGAA_3′。 1.2 加入rol/lrt的/amv体系 按照TRIzol试剂盒说明提取病毒RNA,加入经DEPC处理的灭菌超纯水12μL溶解RNA。取7μL RNA,加入10mmol/L RT引物4.5μL,经70℃变性5min后,冰浴5min,依次加入下列体系:5×RT buffer 4μL;10mmol/L dNTP 2μL;40U/μL RNasin 0.5μL;10U/μL的AMV 2μL,反应总体积20μL,混匀,37℃水浴1h。然后,95℃ 5min,冰浴5min,-20℃保存。合成的cDNA可作为PCR扩增F和HN的模板。 1.3 循环时间的选择 F(HN)反应条件:94℃ 3min;94℃ 1min,54℃ 1min,72℃ 2.5min(HN为2min),33(HN为32)个循环;72℃延伸10min。反应产物1%琼脂糖凝胶电泳检验。 1.4 yvector的培养 回收PCR产物,将回收物连接16℃ 1.5h至pGEM_T Easy Vector,转化至感受态DH5α,均匀涂布于含Ampicillin、IPTG、X_Gal的LB固体培养基平板,37℃培养14～16h。挑取白色菌落小量培养,作EcoRⅠ酶切鉴定和PCR扩增双重鉴定。 1.5 ndv毒株的构建 将阳性质粒送上海博采生物技术有限公司测序。另从GenBank中获取同时发表F和HN序列且代表不同基因型的11个NDV毒株(表1),用于这两个基因的比较。利用DNAStar 6.0软件,按传统基因分型方法对F基因分型。 1.6 不同中毒猪f和hn基因遗传变化之间的相关比较 1.6.1 氨基酸aa同源性分析 利用DNAStar 6.0软件分别对NDV不同F和HN基因片段进行核苷酸(nt)和氨基酸(aa)同源性比较,利用SPSS8.0统计学软件对其同源性进行相关分析。以不同NDV毒株F全长基因的nt同源性为纵坐标,以不同毒株F基因高变区(1～374nt)的nt同源性为横坐标作图。按同样方法构建HN基因及其高变区(1～270nt)相关图。 1.6.2 基因同源分析