粗纤维在电针四白穴对内脏痛镇痛效应中的作用.docxVIP

粗纤维在电针四白穴对内脏痛镇痛效应中的作用 根据研究，针灸可以促进不同类型的传统纤维，但粗纤维（a）和薄纤维（a）在针灸和镇痛中的主要作用没有特异性。一些学者认为中等粗细的Ⅱ类纤维 (Aβ) 可能在针刺镇痛中发挥主要的作用;另有研究则表明, 针刺主要激发穴位深部感受器, 通过较细的Ⅲ类 (Aδ) 和Ⅳ类 (C) 纤维传入中枢引起镇痛效应。我们的前期研究表明, 辣椒素选择性破坏支配“四白”穴的眶下神经的传入C纤维后, 电针“四白”穴诱导三叉神经脊束核尾侧亚核Ⅰ-Ⅱ板层的c-fos表达明显减弱, 提示C纤维可能是“四白”穴针刺信息的主要传入途径, 电针“四白”穴对内脏功能活动具有显著的调节作用。在此基础上, 进一步研究发现细纤维 (C纤维) 可能是“四白”穴针刺信息的主要传入途径。神经蛇毒富含磷酸酯酶, 可降解髓鞘膜的磷脂, 从而选择性破坏神经纤维的髓鞘, 导致髓鞘纤维粗纤维不能传导冲动, 而对轴丝无影响。因此, 本研究旨在通过神经蛇毒作用于眶下神经, 观察电针口面部“四白”穴对内脏痛大鼠的镇痛效应, 探讨粗纤维在针刺“四白”穴镇痛中的可能作用。 1 材料和方法 1.1 动物分组实验 选用体重180～220 g的成年SD大鼠36只, 雌雄不限, 由广州中医药大学实验动物中心提供。随机分为空白组、内脏痛组、电针组、眶下神经切断组、神经蛇毒组、生理盐水组, 每组6只。本实验遵循国际疼痛研究联合会制定的清醒动物实验性疼痛研究的伦理学指南。 1.2 免疫组化试剂 神经蛇毒 (广州医学院蛇毒研究所) 、c-fos免疫组化试剂盒 (美国SantaCruz公司) 、SABC免疫组化试剂盒 (北京中山生物有限公司) 、DAB显色试剂盒 (北京中山生物有限公司) 、乌拉坦 (北京化学试剂公司) 、乙酸 (北京化学试剂公司) 。CM 1850恒冷箱切片机 (德国Leica) , G 6805-Ⅱ型电针治疗仪 (上海医用电子仪器厂) 1.3 神经蛇毒组 内脏痛模型:大鼠清醒状态下腹腔注射0.6%乙酸 (10 mL/kg) 造成大鼠内脏痛模型, 引起典型的腹部肌肉收缩, 同时伴有一侧后肢外伸。 眶下神经的处理:10%乌拉坦 (1 mL/100 g) 腹腔注射麻醉后, 手术游离出双侧眶下神经约1 cm, 眶下神经切断组直接切断双侧眶下神经;神经蛇毒组用0.3 mg神经蛇毒溶液对眶下神经缓慢进行鞘内注射, 注射过程中严禁药液漏出浸润周围组织, 在其下垫一大小合适的塑料薄膜。生理盐水组则用生理盐水代替蛇毒溶液, 其余处理与蛇毒组相同。眶下神经处理后, 缝合切口动物存活5 d待其完全恢复后再进行电针及腹腔注射乙酸。 1.4 神经蛇毒组对内脏痛模型的处理 空白组大鼠腹腔注射生理盐水 (10 mL/kg) ;内脏痛组大鼠造成内脏痛模型。电针组先电针双侧“四白”穴20 min, 疏密波, 2 Hz/20 Hz, 强度以肉眼可见大鼠局部组织颤动为度, 再造成内脏痛模型;眶下神经切断组先行切断双侧眶下神经, 再电针双侧“四白”穴20 min, 最后造成内脏痛模型;神经蛇毒组首先用神经蛇毒处理双侧眶下神经, 其余处理同眶下神经切断组;生理盐水组用生理盐水替代神经蛇毒处理双侧眶下神经, 其余处理同眶下神经切断组。穴位定位采用比较解剖学进行大鼠穴位定位, “四白”穴位于眶下缘, 眶下孔凹陷处。 1.5 免疫组织合成 扭体反应:腹腔注射生理盐水或乙酸后, 观察并记录60 min内大鼠腹部收缩的次数。 c-fos表达:各组动物经处理后存活2 h, 开胸经升主动脉插管进行灌流。先用生理盐水100 mL快速冲洗血液, 然后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PB (pH 7.4) 400 mL灌注固定50～60 min。灌注完毕后立即取延髓, 置于上述灌流液中后固定4～6 h, 再移入20%蔗糖PB中过夜 (4 ℃) 至组织块沉底。次日取出组织做连续冠状切片, 片厚40 μm, 切片隔两张取一张, 收集于0.01 mol/L的PBS (pH 7.4) 中, 进行免疫组织化学反应。切片首先入0.03%的H2O2溶液中, 室温30 min。入0.3%TritonX-100, 室温30 min。封闭用10%正常羊血清, 室温20 min。多克隆兔抗c-fos血清 (1∶100) , 置于湿盒中4 ℃冰箱中过夜。生物素标记的羊抗兔IgG, 室温1 h。辣根酶标记链酶卵白素复合物S-A/HRP工作液, 室温1 h。DAB显色, 室温3～5 min。上述各步骤之间均用0.01 mol/L (pH 7.4) PBS洗涤3次, 每次5 min。切片裱于涂有明胶的载玻片上, 梯度酒精脱水, 二甲苯透明, 中性树胶封片。室温晾干后, 光镜下观察、计数。空白对照用PBS替代兔抗c-fos血清进行上述免疫