荧光素pibb双标神经元的臂旁观察.docxVIP

荧光素pibb双标神经元的臂旁观察 臂侧核（pbn）是肝脏引入中的一个重要的中继核团。它不但参与内脏的活动,而且接受体感传入,并且与痛觉调制具有密切关系。以往的研究表明,PBN与脊髓(spinal, SP)、孤束核(nucleus of solitary tract, NTS)之间具有往返的纤维联系,这些纤维是体感、内脏信息传入的重要组成部分。本实验的研究目的是探讨PBN中的神经元向SP、NTS的轴突是否具有分支投射现象。 1 材料和方法 1.1 微玻管、热注射、高主动脉灌注 健康成年大白鼠40只,体重250～300 g,雌雄不拘。戊巴比妥钠(20 mg/kg)腹腔麻醉后将大鼠固定于日产SN-2型脑立体定位仪上,切开项背部皮肤,分离项部肌肉,暴露颅骨后去掉部分枕骨,用吸引器吸掉小脑蚓部,暴露第Ⅳ脑室底部,体式显微镜直视下于孤束核尾段用微玻管(直径:内径70 μm,外径100 μm)单侧缓慢压力注入1%的Propidium Iodide(PI)0.5～1 μl,注射时间为15～20 min,起针后局部缝合,动物存活48 h。再次麻醉后,在胸腰段切开皮肤,分离腰部肌肉,暴露腰椎横突,去掉椎板,暴露脊髓,用微玻管在腰膨大同侧脊髓背角缓慢压力注入1%的Bisbenzimide (Bb)0.5～1 μl,注射时间为15～20 min,起针后局部缝合,动物存活12～16 h。再次麻醉,升主动脉灌注,灌流液依次为4%的柠檬酸钠5 ml、生理盐水200 ml、含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸缓冲液(pH 7.4)300 ml、含10%蔗糖的磷酸缓冲液200 ml,灌流时间60 min。立即取脑干和脊髓(注射部位),置于含20%蔗糖的磷酸缓冲液中,4 ℃冰箱过夜,冰冻连续切片,片厚50 μm,吹干后荧光显微镜及激光共焦扫描显微镜观察。 1.2 pi-bb双标细胞的检测 Olympus落射式荧光显微镜观察: 采用紫外光(UV,365 nm)激发,530阻挡滤片进行观察。PI的激发波长为600～610 nm,为桔红色荧光,标记胞浆;Bb的发射波长为500 nm,为蓝绿色荧光,标记胞核。其中只见PI标记的红色胞浆,胞核未被标记或被掩盖或核处红色荧光较弱者,为PI单标细胞;只见Bb标记的蓝绿色胞核,胞浆不发荧光者为Bb单标细胞;既可见到桔红胞浆又可见到蓝绿色胞核的,为PI-Bb双标细胞。因两种波长的光相干涉,有时可见胞浆为黄橙色,胞核为黄绿色。 激光共聚焦扫描显微镜观察: 采用美国Meridian公司的ACAS575激光共聚焦扫描显微镜,UV激发,双染样本扫描分析软件,采用镜扫描和台扫描,检测器1的滤片530/30 Bp,检测器2的滤片605 Lp。扫描参数如下:激光功率:60 mW,扫描强度:50%, 针孔:500, 自动放大:8,样本点数:30。 2 鉴定elliker-sfsek-f亚核的pi-bb亚核 切片证实各例实验动物的PI、Bb注射部位基本上均局限于一侧脊髓背角和孤束核内。选用注射部位准确,各种标记细胞的数目相差不太显著的8只大鼠描述标记细胞的分布并计数(见表1)。标记细胞的分布(图1) :荧光单、双标记细胞位于PBN的Kolliker-Fuse(K-F)亚核,Bb单标细胞多位于K-F核的尾侧1/3段,中段较少,吻段未见,占标记神经元总数的40.08%;PI单标细胞多位于K-F核的吻侧1/3段,中段较少,尾段未见,占标记神经元总数的43.62%;在K-F核的中段,可见PI-Bb双标记细胞,占标记神经元总数的16.28%。标记细胞多位于注射部位的同侧,对侧偶见,大小以中小型为主,未见大型细胞,形态以三角形、多极型为多,也可见椭圆形和梭形细胞,直径为10～18 μm(图2)。另外,在外侧臂旁核(LPBN)的外外亚核(external lateral subdivision, el)及内侧臂旁核(MPBN)的外内侧亚核(external medial subdivision, exm)也偶见少量单、双标细胞。 3 pbn向髓孤束核的释放 以往的结果表明,脊髓的不同板层向臂旁核的不同亚核投射,投射神经元多位于Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、后联合核、外侧脊髓核及外侧颈核。孤束核的不同亚核向臂旁核的不同亚核投射,这种投射具有功能定位关系。另外,用溃变和HRP顺行追踪结果表明,在外侧臂旁核吻侧LPBN中有一局限的区域接受脊髓和孤束核的传入,且这一区域的神经元进一步向上传入下丘脑。电生理的结果表明,这一区域的神经元接受体表内脏信息传入的汇聚,即它可被来自皮肤的伤害性刺激和来自内脏的伤害性刺激所激活。对PBN向脊髓和孤束核的投射研究较少,据报道PBN的K-F核发出纤维投射至脊髓,Fulwiler认为主要位于K-F核尾侧1/3,PBN向脊髓各节段的投射无定位分布。本实验中