《食品和化妆品中抗氧化功效的测定 体外角质细胞SOD酶活法》（征求意见稿）.docx

3 T/GDFCA 0XX—202X 食品和化妆品中 抗氧化功效的测定 体外角质细胞 SOD 酶活性法 1 范围 本文件规定了角质细胞分泌物SOD活性测定试验的基本技术要求。 本文件提供了一种经由角质细胞分泌物SOD活性的检测方法，可作为化妆品、食品原料关于抗氧化 功效称谓的证据支持之一。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 SN/T 3899—2014 化妆品体外替代试验 良好细胞培养和样品制备规范。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 人永生化角质细胞 HaCaT 该细胞来源于正常成年人的皮肤组织，是在体外培养后自然转化的永生化的人角质细胞。角质细胞 是构成人体表皮的主体细胞，体内呈分层生长排列，可用于人表皮细胞角化的研究。 3.2 超氧化物歧化酶 Superoxide dismutase，SOD 超氧化物歧化酶 (SOD) 是一种重要的抗氧化酶，可在角质细胞、肝脏组织等胞内生产，它可以催 化超氧阴离子 (O2-) 的歧化反应，生成过氧化氢和单质氧。 4 原理 生物体内的自由基已成为研究的热点，超氧化物歧化酶 (SOD) 作为天然的抗氧化酶，可在细胞内 生成。在测定SOD活性时，SOD能催化超氧化物阴离子发生歧化作用，所以基于NBT或WST的显色反应可以 被SOD所抑制，因此SOD的活性与甲臜染料的生成量成负相关，从而通过对显色产物的比色分析即可计算 SOD的酶活力。通过比较阴性对照与受试物给药组的显色底物的吸光值，可计算SOD酶活上调率。 5 试剂 除非另有规定，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。与细胞培养相关试剂、耗材 应作无菌处理。 5.1 细胞培养涉及试剂及耗材 胰蛋白酶/EDTA溶液（0.25%胰酶溶液与0.02 mol/L EDTA溶液1:1 混匀），磷酸盐缓冲液（PBS）， 细胞培养瓶，青霉素-链霉素，DMEM培养基（含2mM L-谷氨酰胺、4.5g/L 葡萄糖）或其他经验证合适的 培养基，完全培养基需添加10%新生牛血清。 5.2 检测涉及试剂及耗材 Western及IP细胞裂解液(Cell lysis buffer for Western and IP)：一种在非变性条件下裂解细 胞或组织样品从而制备蛋白样品的裂解液，苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）： 蛋白酶抑制剂，超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒，阳性物质：表儿茶素 CAS 490-46-0，制备高浓度样 品溶液：二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、无水乙醇、灭菌超纯水。 6 材料 4 T/GDFCA 0XX—202X 6. 1 微孔滤膜：0.22 μm。 6.2 细胞培养板（规格 24 、12 孔、6 孔均可）。 6.3 细胞培养瓶。 6.4 无菌旋盖离心管（15 和 50mL），无菌离心管（1.5 和 2.0mL）。 7 仪器和设备 7.1 天平：感量为 0.1mg 7.2 生物安全柜：生物 II 级 7.3 恒温水浴锅 7.4 二氧化碳培养箱：37℃, 5%CO2。 7.5 pH 计：精度±0.1。 7.6 低温离心机 7.7 涡旋振荡器 7.8 微孔板酶标仪或分光光度计，配置 450nm 或 560nm 滤光片 7.9 高压灭菌器 7. 10 无菌微量移液器：1-10μL；20-200μL；100-1000μL 7.11 倒置显微镜 8 试样的制备 8.1 受试物准备 8.1.1 除非有稳定性数据证明储备液可接受，否则受试物必须在使用前新鲜配置直接使用。 8.1.2 水中溶解度受限的受试物应当溶解在适当的溶剂中，溶剂体积应在所有培养物中保持一致， 并 且无细胞毒性。 8.1.3 受试物浓度的选择应避免出现沉淀和溶液呈现云雾状。 8.1.4 宜使用二甲基亚砜（DMSO）和无水乙醇为溶剂，其他低细胞毒性的溶剂也可使用。 8.1.5 在使用溶剂前，应仔细评估它们的特殊性质，例如：是否与受试物发生反应，或溶液中的化学 稳定性。 8.1.6 可使用涡旋混合/或超声处理和/或加热到适当温度等方法辅助溶解，除非这些操作会影响到受 试物的稳定性。 8.2 样品配制 8.2.1 在无菌条件中，使用 1.5mL 或 2.0mL 无菌离心管完成样品母液制备（制备量应大于 1.5mL）， 使用 0.