复元胶囊对实验性膝骨关节炎大鼠病理形态及血清软骨寡聚基质蛋白的影响.docxVIP

复元胶囊对实验性膝骨关节炎大鼠病理形态及血清软骨寡聚基质蛋白的影响 最近发现的一种新发现的革兰氏遗传因子蛋白（comp）是一种新发现的细胞外基质蛋白。作为一个生物指标，它可以作为一个生物特征来早期诊断关节疾病。复元胶囊是临床上长期用于治疗骨关节炎 (OA) 有明显疗效的中药复方实验制剂。本实验采用Hulth法建立大鼠实验性OA动物模型, 以临床上常用于治疗OA的中成药壮骨关节丸作对照, 观察复元胶囊对实验性OA模型病理形态及血清中COMP的影响。 1 材料和方法 1.1 药品来源、药品及复元胶囊 ①实验动物:雄性成年SD大鼠72只, 体重200～250 g。由重庆医科大学实验动物中心提供。实验动物生产许可证号:SYXK (渝) 2002007。②实验药物:复元胶囊由人参、淫羊藿、鹿茸、黄芪、川芎、当归、枸杞子等组成, 委托重庆希尔安药业有限责任公司制成胶囊, 仅供实验使用 (医院制剂批号:12号B-55) 。壮骨关节丸, 由深圳三九医药业股份有限公司生产, 批号: 1.2 术后大鼠术后时间 ①动物分组:72只SD大鼠随机分成4组, 分别为正常组、模型组、壮骨关节丸组以及复元胶囊组, 每组18只。②建立动物模型:除正常组外, 其余各组参照Hulth法造模。0.5%的水合氯醛按0.35 g/100 g腹腔注射麻醉大鼠, 在无菌条件下切断右膝内侧副韧带、切除内侧半月板以及剪断前交叉韧带, 逐层缝合, 无菌包扎。术后每天肌注青霉素2×104U/kg, 共3 d。1 w后, 每天驱赶大鼠跑步30 min。③给药:根据Meeh-Rubner公式计算大鼠的给药剂量。手术后第2周, 复元胶囊组给予复元胶囊0.72 g·kg-1·d-1(相当生药5.76 g·kg-1·d-1) 、壮骨关节丸组给予壮骨关节丸1.14 g·kg-1·d-1配制成3 ml溶液, 正常组、模型组分别给予生理盐水3 ml, 每天灌胃1次。 1.3 小鼠股骨三种主要病理改变及免疫组化检测 ①X线影象检查:分别于灌胃后4、8、12 w随机选取各组大鼠6只, 麻醉后, 仰卧位, X线摄片。膝关节X线评级:0分:正常;1级:软骨面模糊, 软骨面不光滑, 计2分;2级:软骨平台有鼠咬样改变或软骨变薄, 关节变粗大, 计4分;3级:有骨刺或有软骨下囊肿, 计6分。统计时计算每一只大鼠X线影象的积分。②大体观察关节软骨:摄片后的大鼠抽取血液后处死, 观察膝关节有无关节积液及滑膜肿胀, 并于解剖显微镜下观察股骨内髁关节面的病理改变。③光镜观察软骨细胞及基质:取股骨内髁全层软骨标本置于4%中性缓冲甲醛溶液中固定, 常规石蜡包埋、切片, HE染色观察软骨组织的结构、细胞数量和潮线的完整性。依据Mankin法中的结构、细胞、基质以及潮线的完整性进行OA评分。④电镜观察软骨细胞及基质:锐利刀片切取1 cm3大小股骨内髁损伤部位全层软骨, 立即放入4℃的2.5%戊二醛中固定2 h。10%EDTA脱钙3 w, 1%锇酸固定2 h, 4℃冰箱内用乙醇逐级脱水, 环氧树脂包埋, 超薄切片50～60 μm, 电子染色, 并在HITACHI-7500型透射电镜下观察。⑤ELISA法测定血大鼠清中COMP水平:从大鼠上腔静脉抽取静脉血10 ml, 所有标本均离心后吸取上清, 放置于-20℃冻存待测。测试前取出标本, 室温放置30 min。试剂为瑞典Anamar Medical AB公司生产的COMP ELISA试剂盒。用移液管吸取标准品、对照样本及稀释后的检测样本各25 μl, 加入孵育液100 μl/孔;室温孵育2 h;洗液洗板6次, 吸走液体后, 加入抗体复合物200 μl/孔;室温孵育15 min, 每孔中加入停止液50 μl。于450 nm波长处测定, 根据A值与分子量计算COMP相对含量。 1.4 织物上的anoa方差分析 统计分析采用SPSS10.0统计软件处理, 数据以ˉx±s表示, 组间比较用One-Way ANOVA方差分析, 均数比较采用S-N-K检验。 2 结果 2.1 各组患者x线影像积分的比较见表1 见图1, 正常组胫骨平台呈半圆形, 表面光滑, 无增生迹象。4w时, 模型组胫骨平台及股骨内髁边缘模糊, 右侧关节比左侧关节明显肿大;复元胶囊组和壮骨关节丸组关节肿大, 壮骨关节丸组有的关节边缘稍模糊。8w时, 模型组胫骨平台边缘不光滑, 表面有毛刺样增生, 胫骨平台及股骨内髁外侧可见唇样增生, 右侧关节比左侧关节明显粗大;复元胶囊组, 有2例胫骨平台表面变得粗糙, 较对侧明显粗大, 其他4例主要表现为胫骨平台表面欠光滑;壮骨关节丸组6例中有4例关节明显粗大, 胫骨平合表面粗糙, 模糊, 有2例软骨表面模糊伴变薄。12w时, 造模组胫骨平台半圆形结构消失, 有的变