复元胶囊诱导气虚血瘀证大鼠血管平滑肌细胞凋亡的分子机制研究.docxVIP

复元胶囊诱导气虚血瘀证大鼠血管平滑肌细胞凋亡的分子机制研究 世界上每年有900万人死亡，占所有死亡原因的1.3%。中医早就认识到,心脑血管病“其来也渐,其发也骤,其死也速,其愈也缓”,其病机主要是气虚血瘀,治疗应以益气活血为主。这些认识见于对“心痛”、“胸痹”、“痰饮”、“中风”等疾病的论述。现代研究认为,气虚血瘀是心血管疾病的病机关键。近来有研究报道,在动脉粥样硬化(AS)所引起的心血管疾病可见血管壁中膜层的平滑肌细胞向内膜迁移及过度增殖。血管平滑肌细胞凋亡不足是AS早期发生的重要因素。细胞凋亡是受基因调控的主动性死亡,bcl-2和bax是与细胞凋亡关系较为密切的两种基因。bcl-2和bax比值是决定细胞是否发生凋亡的关键。近来有研究报道,中医用益气活血法防治AS取得可喜成就,其机制与调节血脂代谢,改善血液流变性,抑制脂质过氧化,保护内皮细胞功能等方面有关,但从影响血管平滑肌细胞凋亡的角度研究甚少,。复元胶囊由黄芪、淫羊藿、川芎、当归、枸杞等组成,具有益气补肾活血之功效。通过以往研究证实,复元胶囊通过益气、活血治疗能明显改善气虚血瘀证患者的血液流变学、心脑血流动力学及血管活性物质的失衡状态。本研究旨在原有研究基础上,进一步探讨复元胶囊对气虚血瘀血管平滑肌细胞凋亡的影响,从细胞凋亡分子生物学、基因表达等角度研究复元胶囊作用于气虚血瘀证的可能机制,为更深入的临床研究提供依据,并为中医药在治疗气虚血瘀证的实验研究方面作出有益的探讨。 材料和方法 1 实验材料 1.1 动物合格号 SD大鼠40只,雌雄各半,月龄16月,体重600～800 g,重庆医科大学动物中心提供,动物合格证号:SCXK(渝)2007-0001。复元胶囊,重庆希尔安药业有限公司生产,为道地药材(经过专家鉴定和指纹图谱分析),生产批号:070625,每粒含量0.40 g。 1.2 标记检测试验 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)检测试剂盒,购自Boehringer mannheim公司。bcl-2,bax蛋白多克隆抗体购自北京中杉生物技术公司。 2 大鼠的一般情况 将大鼠随机分为3组:正常对照组(n=10),模型组(n=15),复元胶囊组(n=15)。模型组、复元胶囊组按王键等制作气虚血瘀证大鼠模型方法造模:① 饥饿。大鼠按40 g·kg-1·d-1提供饲料,每日8∶00给予全天量的2/3,20∶00给予剩余1/3饲料。② 疲劳。大鼠每日14∶00开始分批置入直径50 cm,高100 cm的水桶内,桶内水深约45 cm,水温与室温均保持为(10±0.5) ℃。以木棒拨打强迫其不断游泳直到疲劳,时间长短存在个体差异,平均为(10±5) min。③ 寒湿。游泳后捞出大鼠,不予保温措施及擦拭水迹,关闭门窗任其暴露于空气中自然晾干。④ 惊慌忧恐。将未游泳大鼠放置水桶旁,任其倾听正在游泳大鼠挣扎叫声。⑤ 高脂饮食。将特制脂肪乳按5 mL·kg-1加人大鼠日常饮水中,脂肪乳配方每500 mL由猪油20 g,胆固醇10 g,胆盐2 g,聚山梨酯-80 20 mL,1,2-丙二醇20 mL,用适量蒸馏水配制而成。造模时间为4周。复元胶囊组大鼠给予复元胶囊1 g·kg-1(复元胶囊溶于生理氯化钠溶液);模型组和正常对照组给予等容量生理氯化钠溶液,qd,每次灌胃容量为13.3 mL·kg-1,喂养1个月。 3 观测指标 3.1 免疫组化检测 将各组大鼠麻醉后取一侧股动脉血管平滑肌,迅速固定于4%多聚甲醛中,制成石蜡切片,以做凋亡及免疫组化检测。取另一侧股动脉血管平滑肌,迅速固定于10%戊二醛中,置于4 ℃冰箱保存,备电镜检测各组平滑肌细胞形态学差异。 3.2 对赫染色的形态观察 将石蜡切片脱蜡后切片苏木素一伊红(HE)染色,光镜下观察血管内膜、中膜情况。 3.3 eli等阳性细胞 TUNEL细胞凋亡检测试剂盒,按Gavrieli等所述方法进行。阳性细胞为细胞核出现褐色,即凋亡细胞。计算凋亡指数(SMAI): SMAI/%=阳性细胞数/细胞总数×100。 3.4 微生物样本的检测 股动脉平滑肌细胞bcl-2,bax的表达采用链酶抗生物蛋白-过氧化物酶(SP)染色法,微波修复抗原,二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染,同时作不加一抗而其他条件均相同的阴性对照。胞浆染有棕黄色颗粒者为阳性。采用医学图像分析系统计算每个视野阳性细胞面积占整体面积的百分数。 3.5 半干活性重质碳酸钙片的制备 标本用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗,1%锇酸铀固定后梯度脱水,环氧树脂618包埋,制作超薄切片,用醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,HU-12A型电镜观察摄片。 4 统计学处理 统计学分析应用SPSS 12.0软件包进行统计学处理。计量资料用xˉ±sxˉ±s表示,采用one-way