多囊卵巢综合征大鼠抗苗勒管素表达与胰岛素抵抗的相关性研究.docx

多囊卵巢综合征大鼠抗苗勒管素表达与胰岛素抵抗的相关性研究 多囊卵巢综合征（p-co）是一种发育障碍和高度异质性的发育障碍。其发病机制尚不清楚。高胰岛素血症及高雄激素血症是PCOS患者主要的内分泌紊乱特征, 是引起PCOS患者局部病理变化的病理生理基础; AMH作为卵巢局部一种重要的调节因子, 在PCOS的发病中的相关作用近年来成为研究热点。目前的研究认为, 高雄激素的发生可能与AMH有一定的相关性［1］, 也有学者认为PCOS患者雄激素水平的升高可能与多囊卵巢组织自身存在IR有关［2］。目前对于卵泡生长发育过程中AMH和IR两者间是否存在相互作用尚未有深入的研究报道。因而, 我们通过制作PCOS大鼠模型, 探讨卵巢局部及单卵泡AMH表达与IR之间的相关性, 以期对PCOS发病机理及临床异质性的分子机制的探讨提供一些实验依据。 1 amh、ir表达强度的检测 1. 1实验对象采用孕激素联合h CG法制作P-COS模型的SD雌鼠作为研究组［3］, 相应SD雌鼠作为对照组。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 血清相关指标测定大鼠于42 日龄左右, 阴道涂片示动情间期当晚8∶ 00 禁食, 次晨8∶ 00 称重。腹腔注入10% 水合氯醛麻醉, 行腹主动脉取血5 ~ 8 ml, 静置30 min后将全血3 000 r / min离心10min得血清。用ELISA方法测定空腹血糖值 ( Fast-ing blood glucose, FPG) 、血胰岛素 ( Fins) ; 放射性免疫法检测血清黄体生成素 ( Luteinizing hormone, LH) 和卵泡刺激素 ( Follicle stimulating hormone, FSH) ;化学发光法检测血清雌二醇 ( Estradiol, E2) 、孕酮 ( Progesterone, P) 及睾酮 ( Testosterone, T) 水平; 计算LH/FSH及HOMA-IR指数 ( HOMA-IR = FPG × FINS/22. 5) 。将经病理证实建模成功的大鼠共37 只按HOMA指数由小到大排列, 取前10 只和后10 只, 中间17 只大鼠剔除实验; 对照组随机取10 只。按照α = 0. 05 的标准, 将其分别与对照组行两t检验, 成功分为三组: 与对照组无统计学差异的为PCOS无IR组 ( n = 10 ) , 有统计学差异的为PCOS并IR组 ( n = 10) , 对照组 ( n = 10) 。 1. 2. 2 卵巢组织免疫组织化学分析将入选大鼠卵巢石蜡包埋, 切片; 采用免疫组化Envision法进行检测, 按照Chem MateTMEnvision + HRP或DAB检测试剂盒说明书进行, 工作浓度为1∶ 20, 以细胞质中有棕黄色或者棕褐色颗粒出现为阳性表达。 1. 2. 3单卵泡AMH与Ir表达强度比较高倍镜下 ( × 200) 每张免疫组化图片中计数卵泡直径 5mm的窦前卵泡5 个, 计算每个卵泡阳性单位 ( PU值) , 则每张图片的PU =1/5 ( PU1+ PU2+ PU3+ PU4+ PU5) , 图像分析采用Leica Qwin计算机图像分析系统自动测试。高倍镜下 ( × 200) 随机取5 个单卵泡视野, 计算阳性单位 ( PU) 行AMH和Ir表达强度的半定量分析。PU = ( Gα - Gβ) /Gmax × 100, Gα 为待测部分平均灰度, Gβ 为背景平均灰度, Gmax = 256 为检测仪器的最大灰度。 1. 2. 4卵巢局部AMH与Ir表达强度比较同一大鼠卵巢制备的2 张切片分别行AMH和Ir的免疫组化, 取相同放大倍数 ( × 20) 同等面积, 尽量选取2 ~ 3 处相同区域, 分别计算此区域AMH和Ir表达强度的PU值, 最后取平均值。可表示每一卵巢的AMH和Ir表达强度, 进行比较和相关性分析。 1. 3 统计学处理所有数据均以x－± s表示, 采用SPSS13. 0 软件进行数据统计分析, 组间差异比较时, 若数据符合正态分布, 采用t检验和方差分析, 若数据不符合正态分布, 经LN数学换算, 若新变量符合正态分布, 仍采用t检验和方差分析, 否则采用Mann-whitney U检验和Kruskal-Wallis检验。以P 0. 05 为有统计学差异。 2 amh表达强度的相关性分析 2. 1血清指标检测结果三组间LH/FSH水平无明显统计学差异, 实验组T及Fins水平明显高于对照组 (P0.05) ;PCOS无IR组FPG水平与对照组无明显统计学差异 (P0.05) ;PCOS并IR组的血清T和Fins较无IR组更高 (P0.05) 。见表1。 2. 3卵巢局部AMH表达及与Ir表达强度比较及相关性