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黑松树木段中的杀线生物测定 在这项工作中，我们研究了一种新的生态法，即使用黑松树树枝直接选择杀松剂的测定方法。作者通过对黑松枝条测定含水量、放入的线虫数及灭菌处理后对线虫繁殖的影响进行了初步的试验,确定了采用黑松枝条(把枝条加工成木段)的方法,给它与林间相近的温度、湿度、枝条含水量和黑暗条件等来模拟林间情况进行试验。目的是寻找一种操作简单又能接近实际地表现出药物在树体中对线虫产生作用的方法。 1 材料和方法 1.1 黑松树枝条的收获和加工 在南京林业大学植物园采集新鲜健康的黑松树枝并加工为直径3 cm,厚度0.5 cm的木段。 1.2 黑松枝的平均含水量的测定 取木段3块标记为1,2,3号,用电子天平称出它们的重量。将这3块木段放入玻璃皿中置于干燥箱中干燥12 h后取出测定干重,计算出黑松枝的平均含水量为65.74%。这项实验的目的是为在其后试验中确认木段含水量对杀线作用的影响做准备。 1.3 培养基的制备 从南京市伊刘苗圃自然感病的15～20 a生黑松Pinus thunbergii上取病材样品,采用贝尔曼漏斗法分离线虫。配制PDA培养基,将配好的培养基放入灭菌器121 ℃下灭菌30 min。在无菌室里,将灭菌后的培养基倒入培养皿,待其凝固后加入灰葡萄孢菌置于光照培养箱,过5～7 d后,灰葡萄孢菌已长满培养皿时,从松萎蔫病死木中分离线虫,将分离的线虫加入长满灰葡萄孢的培养皿中,约10 d后线虫已在培养皿中繁殖充分,将培养皿密封后放入冰箱中低温保存备用。 1.4 木段含线虫数的确定 取出已长有松材线虫的培养皿中的培养基用漏斗法分离线虫。 将分离的线虫在离心机1 500 r/min下离心5 min,在显微镜下计数,分别配成每滴(约0.02 mL)约含线虫数为:50,100,200,400,800条5个浓度的线虫溶液。取黑松木段20块,平均分为5组,每一组木段都对应一个线虫浓度。每块木段滴相对应的线虫液一滴(约0.02 mL),使各组的每个木段含线虫数分别为50,100,200,400,800条。同一组的木段放入同一培养皿中,在培养皿中加入含有少量水的脱脂棉球,以保证培养皿中湿度,用蜡膜封培养皿。将培养皿放在温度为25 ℃、黑暗条件下培养。8 d后用贝尔曼漏斗法分离松材线虫,用显微镜观察统计从各木段中分离的线虫数。 1.5 木段和线虫对线虫繁殖的影响 1.5.1 线虫筛冲液制备 将分离培养好的线虫放入已配好的琼脂培养基上,置于25 ℃的恒温箱内,12 h后用显微镜观察其产卵情况。发现有卵产生后,用蒸馏水冲洗培养基表面,将冲洗液(含有带菌的线虫卵)注入离心管中,离心5 min, 1 500 r/min,去上清液9 mL,留1 mL。加双氧水1 mL,摇匀后在15 ℃下静置10 min, 加无菌水10 mL离心,去上清液9 mL,得冲洗液1 mL。重复冲洗4次后,用180目和200目筛把冲冼液中大的线虫筛出来,留下的过滤液含有少量的线虫和所要的无菌卵。整个过程应保持无菌操作。 1.5.2 木段的密封保存 取灭菌后的木段8块,分2组。第1组,在每块木段内放入无菌线虫卵8粒,并放入培养皿中密封保存;第2组,每块木段内放入带菌线虫卵8粒,并放入培养皿中密封保存;再取没有灭菌的木段4块,每块木段放带菌线虫卵8粒,并存于密封培养皿中。将所有放有木段的培养皿放在25 ℃黑暗条件下培养,8 d后用贝尔曼漏斗分离法检测木段中线虫的繁殖情况。 2 结果 2.1 木段接种不同线虫密度的实验 将所得结果作图1。从图1可以看出,在接种线虫50～400条之间线虫繁殖曲线呈上升趋势,在接种400条之后曲线接近水平。 本实验确定在8 d后观测是考虑到线虫一般繁殖约4～5 d 1代,8 d可繁殖1代以上。实验中接种200条松材线虫,8 d后测得其平均线虫数为629条;而加入400条和800条的培养皿中分离得到的线虫数相当于1 351.75条和1 374.5条;在木段上接种线虫300条,培养8 d后仍不是饱和的,还有一定的食物和生存空间可用。所以,作者认为在今后相关的实验中在直径3 cm、厚0.5 cm的木段接种300条线虫是较为合理的。这样保证了线虫在木段中的充分繁殖有足够的食物和空间,不会因食物和生存空间不够而导致非药物死亡,进而影响杀线剂试验结果的准确性。 2.2 木段中水的总量测定 将结果作图2,由图中可看出当木段中含水量小于40%时,线虫的正常繁殖受到制约,线虫繁殖少;当木段的含水量在40%～60%时线虫数相近;在含水量大于60%时线虫繁殖也受到一定的影响,线虫数开始有下降的趋势。因此,我们生测条件确定为,在木段中接入线虫和加入药剂时带入的水的总量应使木段中的含水量保持在40%～60%之间。同时,应在培养皿中加入浸水棉球,以保证整个试验过程中木段含水量的一