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黄瓜抗肺病分子标记的ssr分析 黄瓜是一种广泛发生的世界疾病。在我国春保护地和夏秋露地种植的黄瓜,每年都因白粉病的发生造成大量减产。因此,培育和推广抗病品种是防御白粉病的一条经济、有效的途径,这对于提高黄瓜产量、增加经济效益具有重要意义。 黄瓜白粉病的田间鉴定工作受季节限制,且受环境影响较大,鉴定结果往往不够准确。如何快速、准确地获得抗白粉病鉴定结果并应用于黄瓜育种实践中是目前研究的热点。分子标记技术的出现,为黄瓜白粉病抗性鉴定工作提供了一条新途径。目前,关于黄瓜白粉病抗性基因的分子标记研究较少。2004年,张桂华等发现与黄瓜白粉病抗性相关基因紧密连锁的AFLP特异条带,连锁距离为5.56 cM,但AFLP分析技术步骤多、操作复杂,因此众多学者致力于寻找操作简便、稳定的分子标记用于黄瓜白粉病抗性鉴定工作。 本研究以黄瓜抗白粉病亲本WIS2757和感白粉病亲本19032以及它们的F2群体为试材,采用SSR分析技术,筛选与黄瓜白粉病抗性相关基因连锁的分子标记,以期为分子标记辅助黄瓜抗白粉病育种奠定基础。 1 材料和方法 1.1 药物常规研究 WIS2757和19032及其杂交获得的597株F2单株由国家蔬菜工程技术研究中心黄瓜育种课题提供。 母本WIS2757抗白粉病,父本19032感白粉病。 1.2 方法 1.2.1 种子基质的制备 双亲、F1的种子各30粒以及F2群体的597粒种子播于50孔穴盘中,以灭菌的营养土为栽培基质。育苗昼/夜温度为25～28℃/18～20℃。 1.2.2 感病黄瓜植株接种鉴定 采集黄瓜白粉病病叶,选择单菌落进行单斑分离,经过3次分离纯化后将白粉病菌的菌株在感病黄瓜品种上扩繁,用于白粉病的接种鉴定。 在黄瓜幼苗2片子叶展平期接种。采用喷雾接种法。接种浓度为1×104～1×106个孢子/mL。接种后置于白天25～28℃,夜晚18℃左右的温室管理。接种后10～14 d调查发病情况。 1.2.3 病情调查方法 采用Shanmugasundarum等的方法将植株分为抗病、中抗和感病3个级别进行病情调查。抗病表现为植株无白粉或植株下部叶片有1～2个白粉病轻微病斑,引起叶片组织过敏性坏死;中抗表现为子叶和真叶中度染病,但叶柄、茎和下胚轴上无白粉;感病表现为植株的叶片、叶柄、茎以及下胚轴上都覆盖白粉。 1.2.4 e1u模板dna 25 μL的反应体系中含有10×Buffer(Tris-HCl 10 mmol/L pH8.0, KCl 50 mmol/L, MgCl22.0 mmol/L)2.5 μL,2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL,引物30 ng,TaqE 1 U, 模板DNA 10 ng。 反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性1 min,52～60℃退火45 s,72℃延伸1 min,40个循环;72℃延伸7 min。 聚丙烯酰胺凝胶电泳:取SSR扩增样品与上样缓冲液(含98%甲酰胺,10 mmol/L EDTA,0.05%溴酚兰,0.05%二甲苯氰)各5 μL混合,94℃变性5 min,立即置于冰上冷却。每个样品取5 μL上样,用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,75 W恒功率电泳约1.5 h,终止电泳。最后进行银染显色。 琼脂糖凝胶电泳:取10 μL SSR扩增样品,与2 μL溴酚蓝(0.25%溴酚蓝,40%蔗糖水溶液)混匀,点入含0.5 mg/L EB的1.5%琼脂糖凝胶中,在5 V/cm电场强度下电泳1～2 h,利用Kodak EDAS-120凝胶分析仪进行凝胶分析。 1.2.5 ssr标记与张力水基因的遗传关系 用JoinMap3.0软件分析F2分离群体扩增的SSR标记和白粉病抗性基因之间的遗传关系,标记与抗病亲本带型一致的命名为A,与感病亲本带型一致的命名为B,杂合带型记为H,缺失或模糊的带型记作“-”。 2 结果与分析 2.1 下胚轴抗-1基因多态性ss的表达 亲本WIS2757对白粉病菌具有完全抗性,19032感白粉病菌(图1)。F2群体中有35株表现为完全抗病、106株表现为中抗、456株表现为感病,分离比例基本符合1∶3∶12,x2为0.57,与Shanmugasundarum等的研究结果一致。即抗性由1对隐性主基因s,1对显性加强基因R和1对抑制基因I控制,s是抗白粉病的主基因,决定下胚轴抗性;R基因是构成叶部抗性的基础,只有在s基因纯合时才能够加强抗性的表达;抑制基因I存在时,植株只能表现出部分抗性,但I不影响s基因的表达。 2.2 引物与黄瓜基因组的扩增 根据发表文章中公布的黄瓜、甜瓜、西瓜等葫芦科作物SSR引物序列,我们先后合成了439对SSR引物序列。用这些SSR引物对供试亲本材料进行了多态性分析,只有120对引物得到清晰可读的带型,比率仅为27%,远远低于孙小红等的