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黑松离体培养再生体系的建立 黑松树产于日本和朝鲜，形状优美，抗旱性强，抗气候碱，是优良的园林绿化观赏树种，是沿海和山区海滩造林的先锋树种。由于高度感染由松材线虫(Bursaphelenchus xylopshilu)引起的一种毁灭性萎蔫病,原产地日本和我国引种的黑松受害十分严重,近乎灭绝,对林业生产、森林资源和生态环境造成严重的破坏(柴希民和蒋平2003)。开展黑松离体组织培养技术研究,可能是快速大量繁殖优良抗病黑松的最佳途径,在短周期内可实现生产增益,同时也可为采用生物技术对树种进行遗传改良打基础。对此,Kondo和Okamura (1995)以黑松成熟胚、梁玉堂和邢世岩(1990)以针叶束、朱丽华(2004)以无菌实生苗等为外植体建立了黑松器官发生的组织培养再生体系。器官发生途径虽然比较容易建立起植株再生体系,但也有人认为存在植株增殖率低的问题(Thorpe等1991)。而且随着生长时间的延长,不定芽出现生长势衰弱、老化和死亡等现象,致使很多研究仅停留在实验室阶段。因此,要使黑松离体培养技术应用于大规模林业生产,系统研究不定芽的增殖非常重要。 培养基的制备 黑松(Pinus thunbergii Par1.)种子产自山东,为自由授粉的成熟种子。用前作4℃低温处理,参照何月秋(2003)文中的方法培养无菌苗。将萌发生长22 d的无菌苗从子叶着生部位下1 cm处的根切去,子叶连同1 cm长的胚轴用作外植体(子叶/胚轴外植体)。参照朱丽华(2004)文中方法,将诱导培养基稍加改进,接种外植体到附加3mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA的改良GD培养基上,5周后计算诱导率和平均芽数。 试验按两因素完全随机设计,将伸长至2 cm左右的单个芽切下,接种至添加6-BA浓度为0.5、1.0和2.0 mg·L-1,NAA浓度为0.1、0.2和0.4 mg.L-1的GD培养基上进行增殖培养,从中筛选出比较适合的生长调节物质浓度,在此基础上进行不定芽增殖的基本培养基和继代周期的筛选。 以上培养基均添加25 mg·L-1蔗糖、500 mg.L-1水解酪蛋白(CH)、450 mg·L-1谷氨酰胺(Gln)和6g·L-1卡拉胶,pH5.8,121℃灭菌16min。培养温度为(24±1)℃,光照强度40μmol·m2.s-1,光照16 h·d-1。每个试验重复3～5次,每重复包含10～30个外植体,数据采用SPSS软件进行分析。按增殖率(%)=分化芽数(个)/接种芽数(个)×100%、增殖倍数=有效芽数(个)/接种芽数(个)进行计算。 结果 1 种子小芽d后,清芽分清子枝或干酵母芽小芽。在充芽培养时间后,子枝的生长1 黑松子叶/胚轴外植体接种到附加不同浓度6-BA与NAA的改良GD培养基上10 d后,可见到大部分黑松顶芽稍稍膨大。随着培养时间的延长,子叶间及子叶基部见到有绿色小凸起。20 d后,子叶基部长出2～5 mm大小的小芽。以3mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA为宜,诱导率可达96%(图1-a)。 2 培养基及激素对黑松奏长的影响 在以往的报道中多数能够顺利建立黑松组织培养的再生体系,获得其再生植株,但有关中间繁殖体如何大量快速增殖的研究较少,本文探讨不同生长调节物质浓度配比及基本培养基等因子对黑松不定芽增殖的影响,并己诱导出生长正常的第2、3代芽(图1-b、c)。从表1～3可见: (1)将伸长的单个不定芽切下,接种在添加不同浓度6-BA和NAA的培养基上进行增殖的结果(表1)表明,在无生长调节物质培养基中不定芽仅进行伸长生长,一直没有不定芽分化;在含6-BA和NAA的培养基中,1周后可见到不定芽基部膨大,外植体切口处出现少量洁白的愈伤组织,2周后就有腋芽萌动,切口处愈伤组织为黄绿色且疏松,3～4周后在附加0.5～1.0 mg·L-16-BA的培养基中少数外植体子叶基部有芽出现,附加2.0mg·L-16-BA的培养基中大多数外植体基部出现不定芽。细胞分裂素6-BA对不定芽增殖的作用非常关键,6-BA浓度低至0.5 mg·L-1时,增殖倍数均在0.6以下;随着6-BA浓度的增加,增殖倍数明显增加,其浓度为2.0 mg·L-1的培养基中增殖倍数最高;6-BA浓度高于2.0 mg·L-1时,其生长状态逐渐变差,针叶肿大发硬、有玻璃化的趋势,抑制了增殖甚至引起死亡(资料未列出);NAA浓度在0.1、0.2和0.4 mg·L-13个水平内变化时对不定芽增殖影响不大,但超过0.2 mg·L-1时,外植体基部产生直径约1.5 cm的大量愈伤组织团,不利于不定芽生长。在GD+2.0 mg·L-16-BA+0.1～0.2 mg·L-1NAA为黑松不定芽增殖培养基上,能获得生长迅速、健壮、幼嫩的有效不定芽,增殖率高达100%,增殖倍数达4