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松材线虫病菌分离与鉴定 1 松材线虫对黑松苗细菌群落组成的影响 松竹病是一种慢性疾病，在日本、中国、韩国、朝鲜、印度尼西亚、葡萄牙和其他国家广泛存在，造成了巨大的经济损失。这是日本和中国受影响最大的疾病。松竹线是引起疾病的唯一病因，但近年来的研究表明，细菌在疾病的过程中可以发挥重要作用。赵伯光等人第一次根据实验得出结论，松竹线虫病是由线虫和细菌共同感染的一种复合感染疾病的假设，并在随后的实验中得到证实。[4、20、21、24、27、27、28、29]。关于松竹线对细菌繁殖的影响研究很少。在本实验中，我们从疾病的松树中分离并确定了7种假单胞菌和3种其他细菌。在无菌条件下，松竹线对这些细菌的繁殖影响研究为基础，并为今后的松树丝虫和细菌之间的关系提供了基础。 2 材料和方法 2.1 试验材料 2.1.1 线虫分离方法 从采集与野外自然感病枯死的黑松木段上取样,分离方法见文献,将分离并鉴定的线虫培养在长满灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的PDA平板上培养,冰箱保存. 2.1.2 线虫水及筛子过滤 取适量松材线虫,用两层纱布包好,置于贝曼漏斗中,加适量的水,在常温下分离6~24 h;鉴定后离心、去上清液,留下约2 ml,移到琼脂培养基上,用脂膜封口,放入25 ℃的恒温箱中培养;12~18 h后,用水冲洗琼脂培养基,滴管吸取松材线虫水至离心管内,于离心机中离心5 min(1 500转·min-1),吸去上清液,留松材线虫水约1.5 ml,无菌条件下移至另离心管中,线虫水和30%双氧水按1∶1比例混合,将离心管置于15 ℃左右的水中静置10 min;用无菌蒸馏水稀释线虫水3~5遍;分别用180目和200目的筛子过滤;于45倍昆虫解剖镜下挑取卵数个于NA培养基上,检查线虫卵是否带细菌;如果带菌,则放弃本次实验. 2.1.3 伤组织的培养 挑取100个无菌线虫卵于装着黑松愈伤组织(约1 g)和2 ml无菌水的小培养皿中(内径约为1 cm),于28 ℃温箱中培养3 d,备用. 2.1.4 细菌培养和分离 根据松材线虫病在我国的发生、发展、分布和蔓延,选择我国松材线虫病发生的、有代表性的疫区,在2001年春秋两次进行采样.采集了感染松材线虫病的黑松、马尾松病木,采用木块组织分离法,分离松材线虫所携带的细菌58株.利用传统的细菌鉴定方法和自动化细菌鉴定系统相结合的手段,对这些细菌进行了鉴定.笔者从中选取10个菌株,将这些细菌菌株于NA培养基上斜面培养,冰箱低温保存备用. 2.2 学习方法 2.2.1 黑松愈伤组织的诱导 将黑松种子浸泡数小时,去壳,于75%乙醇溶液中表面消毒3次,每次40 s,用无菌水冲洗3次,置于0.1%升汞溶液中浸泡4 min,再用无菌水冲洗5次,在无菌操作台上剥去胚乳得到成熟胚,将其移入灭过菌的装有MS诱导培养基的锥形瓶中,封口,于28 ℃恒温箱中暗培养.两星期后,将诱导出黑松愈伤组织,将生长良好(为乳白色)的愈伤组织移至继代培养基上.在无菌操作台上,将愈伤组织切成黄豆大小,移至装有1/2MS继代培养基的锥形瓶中,每个锥形瓶接入3~4块,于28 ℃恒温箱中暗培养,每隔一个月左右继代一次; 2.2.2 小培养液培养 接种环挑取菌苔5环(直径约为1 cm),悬浮于10 ml无菌水中,即得各种细菌悬浮液,备用,用微量移液器移取2 ml无菌水于小培养皿(内径约为1 cm)内;先后向小培养皿中加入2条雄虫、约0.01 g黑松愈伤组织和0.05 ml细菌悬浮液;每种细菌做4个重复,将小培养皿放入直径为7.5 cm的培养皿中,封口,于28 ℃恒温箱中培养;从第2天到第7天,每天取出一小培养皿,做平板菌落计数;处理的细菌菌株及其对照(不加线虫)的每日细菌的单菌落数目分别取LOG值后作两条曲线,并进行方差分析(SPSS12.0). 3 菌种间竞争的影响 图1结果表明,松材线虫对HeM2A假单胞菌、HeM1A假单胞菌、GcM6-2A恶臭假单胞、GcM6-1A恶臭假单胞菌、ZpB1-2A恶臭假单胞菌、GcM1-3A洋葱假单胞菌以及HM3泛菌属2的繁殖有显著促进作用(P0.01),其细菌数量的对数值曲线全部或大部分情况下高于对照曲线,即加入松材线虫后能显著地促进该菌繁殖,也促进HeM142B假单胞菌的繁殖,但方差分析显示无显著的促进作用.由松材线虫对ZpB4-2B松鼠葡萄球菌和ZpB2-3A河生肠杆菌的繁殖影响的曲线可见,大部分情况下,加入无菌松材线虫的曲线低于没有加入松材线虫对照繁殖曲线,经方差分析表明,加入无菌松材线虫后抑制了两株菌株的繁殖.无论是促进或抑制,各细菌生长的高峰期为处理后的第3天或第4天. 这与细菌在自然状态下的生长趋势相一致. 从松材线虫体上或从病死木分离得到的细菌以假单胞菌属(Pseudomonasspp.)的一些种