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2型糖尿病患者表达胰高糖素样肽-1融合蛋白的表达条件优化 在2型糖尿病的治疗过程中，胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷发挥着重要作用。针对胰岛素抵抗及胰岛素分泌的药物研究在2型糖尿病及其并发症的治疗领域具有非常重要的意义。目前临床应用胰高糖素样肽-1 (GLP-1) 制剂对糖尿病患者的治疗, 已有研究证实效果较好。过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPAR-γ) 可以增加外周组织的胰岛素敏感性, 从而改善胰岛素抵抗, 调节糖代谢, 降低血糖。本实验室前期已通过系统的基因工程技术成功构建人过氧化物酶体增殖物激活受体γ-胰高糖素样肽-1 (PPARγ-GLP-1) 表达载体, 并转入Rosseta (DE3) 感受态细胞获得工程菌株。本研究为获得大量基因重组融合蛋白进行蛋白表达条件优化, 包括诱导时间、诱导剂浓度, 为进一步融合蛋白生物活性测定提供研究基础。 1 材料和方法 1.1 谷物、植物和主要试剂 1.2 培养基lb培养基ph.7.0 1.3 细菌激活 1.4 重组颗粒的诱导表达 1.5 优化优质粒生产条件 1.6 重晶银质纯度 2 结果 2.1 sds-东南角电泳分析 含pET32a-PPARγ-GLP-1质粒的表达菌经IPTG诱导表达6 h, 收集菌沉淀, 经SDS电泳及考马斯亮蓝染色, 融合蛋白在约73 000处有表达条带, 与预期一致 (图1) 。将菌体沉淀超声裂解, 进行SDS电泳分析, 可见上清中不表达目的蛋白而沉淀中有明显的目的条带。 2.2 结合蛋白质的诱导表达 通过不同表达条件优化选择, 在A600为0.5, IPTG浓度为1 mmol/L, 37℃诱导12 h, 可大量表达融合蛋白。 2.2.1 优化选择过程的结果 2.2.2 最优控制访问浓度的结果 2.3 ni-nta亲和层析纯化蛋白的制备 在大肠杆菌中, PPARγ-GLP-1以包涵体的形式表达, 通过稀释复性的方法对蛋白进行变复性。经Ni-NTA亲和层析纯化后, 250 mmol/L Elution buffer洗脱纯化蛋白较好 (图4) 。 2.4 PPARγ-GLP-1的蛋白印迹法鉴定 诱导总蛋白及纯化PPARγ-GLP-1融合蛋白蛋白印迹法结果可知, 融合蛋白可被抗His-tag识别 (图5) 。 3 目的蛋白的表达 本研究目的基因中含有较多稀有碱基, 在普通大肠杆菌中目的蛋白的表达会受到影响。故选择Rosseta感受态细胞, 该菌株补充了大肠杆菌缺乏的6种稀有密码子对应的tR-NA, 可提高真核基因在原核细胞的表达水平。 3.1 目的蛋白表达量 当不同诱导时间对蛋白表达量影响的分析中, 诱导表达10 h以上时, 目的蛋白表达量则不再增加。 因此, 我们选择pET32a载体, Rosseta表达菌株, 诱导表达条件为:37℃, 1.0 mmol/L IPTG诱导表达10 h。 3.2 重组蛋白的诱导表达 本研究通过蛋白印迹法再次鉴定目的蛋白表达成功, 为下一步进行PPARγ-GLP-1融合蛋白生物学活性测定, 检测融合蛋白对血糖, 胰岛素抵抗, 胰岛素β细胞的再生等各方面研究提供了实验基础。 重组质粒pET32a-PPARγ-GLP-1和工程菌株由本室保存。Rosseta (DE3) 感受态细胞、CST anti-His购自康为世纪有限公司, 异丙基硫化半乳糖苷 (IPTG) 购自北京索来宝有限公司;Ni-NTA重力预装柱购自生工生物工程 (上海) 有限公司;二氨基联苯胺 (DAB) 显色试剂盒, 购自武汉博士德生物工程有限公司。 1%Tryptone, 0.5%yeastextract, 1%NaCl;氨苄青霉素:储备液:50 mg/ml (溶于水) , 工作液:100μg/ml。 取-70℃保存的工程菌株划板, 37℃过夜培养, 挑单克隆菌落接种于5 ml LB培养基中 (含氨苄青霉素100μg/ml) , 37℃、200 r/min培养12 h, 取100μl菌液加入含氨苄青霉素的5 ml LB中, 37℃培养至对数期吸光度OD600为0.5, 即为活化菌种。 取活化100μl菌液加入含氨苄青霉素的5 ml LB中, 37℃培养至对数期A600为0.5时, 加入IPTG至终浓度0.2 mmol/L, 37℃诱导表达6 h。取1 ml菌液, 4℃收集菌体沉淀, 加入1×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺 (SDS) 上样缓冲液, 混匀, 煮沸10 min, 取上清进行SDS;剩余菌液离心收集沉淀, 重悬于磷酸盐缓冲液 (PBS) 中, 冰浴超声裂解, 离心取上清5×SDS上样缓冲液, 沉淀加入1×SDS上样缓冲液, 混匀, 煮沸10 min, 进行10%SDS电泳, 分析重组蛋白是否为可溶性表达。考马斯亮蓝R250染色, 分析蛋白表达情况。 本实验对重组